《iScience》：Size-dependent pyroptosis induction by calcium oxalate monohydrate crystals in HK-2 cells
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本研究针对肾结石形成过程中晶体与肾小管上皮细胞的相互作用机制，通过系统研究不同尺寸（100 nm-10 μm）一水草酸钙晶体诱导HK-2细胞焦亡的差异，发现小尺寸晶体（≤3 μm）主要通过内吞作用引发氧化应激激活NLRP3炎症小体，而大尺寸晶体（3-10 μm）主要通过黏附作用诱导内质网应激。晶体尺寸越小，焦亡率越高（COM-100nm达17.81%），揭示了晶体尺寸依赖性的细胞死亡新模式，为肾结石的靶向防治提供了新视角。
在全球范围内，肾结石是一种常见的泌尿系统疾病，其中草酸钙结石占比高达70%-80%。尽管医学技术不断进步，但肾结石的发病机制仍未完全阐明。传统观点认为，一水草酸钙晶体的成核、聚集、生长和黏附过程，以及肾上皮细胞损伤和遗传因素，都是诱导草酸钙结石形成的重要因素。值得注意的是，肾结石的形成过程往往伴随着炎症反应，而焦亡作为一种程序性细胞死亡方式，在感染性疾病、神经系统疾病和血管钙化中发挥着重要作用，但在肾结石领域却鲜有关注。
焦亡本质上是一种炎症过程，依赖于NLRP3-Caspase-1-IL-1β/18通路，并伴随大量炎症介质的释放。基于这一认识，研究人员推测一水草酸钙晶体可能诱导肾细胞发生焦亡，从而促进炎症进程，进一步推动肾结石的发生发展。为了验证这一假设，暨南大学化学与材料科学学院生物矿化与结石研究所的陈学武团队开展了一项创新性研究，系统探讨了不同尺寸一水草酸钙晶体诱导肾小管上皮细胞焦亡的差异及其分子机制。
研究人员首先成功合成了五种不同尺寸的一水草酸钙晶体（约100 nm、1 μm、3 μm、5 μm和10 μm），分别命名为COM-100nm、COM-1μm、COM-3μm、COM-5μm和COM-10μm。通过X射线衍射、傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜和粒度分析等技术对晶体进行了全面表征，确认了晶体的物相组成、化学结构和尺寸分布。
研究团队采用Caspase-1/碘化丙啶双染色流式细胞术定量检测了不同尺寸晶体诱导的焦亡细胞比例。结果显示，小尺寸晶体（COM-100nm、COM-1μm和COM-3μm）诱导的焦亡率较高且相似，分别为17.81%、17.28%和17.25%，而大尺寸晶体（COM-5μm和COM-10μm）的焦亡率显著降低，分别为12.44%和9.05%。这一趋势在Caspase-1/PI/Hoechst 33342三染色共聚焦观察中得到进一步验证。
在机制探索方面，研究人员发现小尺寸晶体（≤3 μm）能够被HK-2细胞内吞，通过透射电镜观察和流式细胞术定量分析证实了内吞效率为COM-100nm > COM-1μm > COM-3μm。内吞后的晶体在溶酶体中分解，导致细胞内Ca2+水平升高，引发线粒体功能障碍，活性氧和一氧化氮水平增加，从而激活NLRP3炎症小体，诱导焦亡发生。Western blot结果显示，小尺寸晶体处理组中NLRP3、cleaved caspase-1 p20、IL-1β和IL-18的表达水平显著上调。
相比之下，大尺寸晶体（3-10 μm）难以被细胞内吞，主要通过晶体黏附作用诱导细胞损伤。流式细胞术分析显示，虽然所有尺寸的晶体都能黏附于细胞表面，但黏附量随晶体尺寸增大而减少。大晶体黏附可能产生剪切应力，导致内质网应激，引起内质网Ca2+释放，加剧氧化应激，进而激活NLRP3炎症小体通路。
研究人员还系统评估了晶体诱导的细胞损伤指标。通过Fluo-4 AM荧光探针检测发现，小尺寸晶体处理组细胞内Ca2+水平显著升高。细胞骨架观察显示，晶体处理导致细胞骨架坍塌，轮廓模糊，小尺寸晶体的破坏作用更为明显。膜电位检测表明，晶体引起细胞膜损伤，导致膜电动势增加，且损伤程度随晶体尺寸减小而加剧。ATP含量测定进一步证实，小尺寸晶体对细胞能量代谢的干扰更为严重。
为开展本研究，作者主要应用了以下关键技术：晶体合成与表征技术（X射线衍射、傅里叶变换红外光谱、扫描电镜）、细胞培养与损伤模型建立、流式细胞术（检测细胞死亡、内吞和黏附）、免疫荧光染色、蛋白质印迹法、共聚焦显微镜观察、氧化应激指标检测（活性氧、一氧化氮、ATP）、细胞内钙离子水平和膜电位测定。
差异研究结果
不同尺寸COM晶体诱导的焦亡差异
通过Caspase-1/PI双染色流式细胞术分析发现，小尺寸COM晶体（100 nm-3 μm）诱导的焦亡率显著高于大尺寸晶体（5-10 μm）。免疫荧光检测显示NLRP3表达水平与焦亡率变化趋势一致，Western blot结果进一步证实小尺寸晶体更能有效激活NLRP3炎症小体通路。
不同尺寸COM晶体诱导的其他死亡细胞检测
YO-PRO-1/PI双染色结果显示，小尺寸晶体诱导的细胞总死亡率（29.04%-21.63%）显著高于大尺寸晶体（13.72%-11.88%），表明晶体尺寸不仅影响焦亡特异性死亡，也影响其他形式的细胞死亡。
HK-2细胞对不同尺寸COM晶体的内吞和黏附差异
透射电镜观察证实HK-2细胞能够内吞尺寸≤3 μm的COM晶体，流式细胞术定量显示内吞效率随晶体尺寸减小而增加。晶体黏附实验表明所有尺寸晶体都能黏附于细胞表面，黏附量随尺寸减小而增加。
不同尺寸COM晶体诱导的氧化应激差异
活性氧和一氧化氮检测表明，小尺寸晶体诱导的氧化应激水平显著高于大尺寸晶体。ATP含量测定显示小尺寸晶体对细胞能量代谢的干扰更为严重，进一步证实了氧化应激在晶体诱导焦亡中的关键作用。
COM晶体诱导焦亡引起的细胞损伤差异
细胞内Ca2+水平、细胞骨架完整性、膜电位等指标检测均表明，小尺寸COM晶体引起的细胞损伤更为严重，这与观察到的焦亡率变化趋势一致。
研究结论与意义
本研究系统阐明了不同尺寸一水草酸钙晶体诱导肾小管上皮细胞焦亡的尺寸依赖性规律及其分子机制。研究发现，晶体尺寸是决定焦亡率的关键因素，尺寸越小，焦亡率越高。小尺寸晶体（≤3 μm）主要通过内吞作用引发溶酶体损伤、钙超载和线粒体功能障碍，导致氧化应激和NLRP3炎症小体激活；而大尺寸晶体（3-10 μm）主要通过黏附作用产生剪切应力，诱导内质网应激，进而激活炎症通路。
这一发现不仅深化了对肾结石形成过程中晶体-细胞相互作用机制的理解，更重要的是揭示了晶体尺寸在决定细胞死亡方式中的关键作用。临床观察发现，尿液微晶体（纳米和微米级）在正常人和结石患者中都存在，但不同尺寸微晶体与焦亡的关系此前未见报道。本研究首次建立了晶体尺寸-细胞死亡方式-炎症反应之间的定量关系，为解释为什么某些微晶体更易引发病理性改变提供了实验依据。
从临床转化角度，这一研究为肾结石的预防和治疗提供了新的思路。针对不同尺寸的尿路晶体，可以开发相应的干预策略：对于小尺寸晶体，可以靶向抑制内吞过程或减轻氧化应激；对于大尺寸晶体，则可以着重阻断黏附作用或缓解内质网应激。此外，焦亡特异性抑制剂可能成为预防肾结石形成的新靶点。
研究的局限性在于尚未收集临床数据来阐明焦亡在肾结石形成中的具体作用。未来需要结合临床、动物和其他体内样本，进一步证实焦亡在肾结石形成中的意义，并开发利用焦亡抑制剂来抑制或延缓肾结石形成的策略。
总之，这项发表于《iScience》的研究不仅为理解肾结石发病机制提供了新的视角，也为开发针对晶体诱导细胞死亡的预防和治疗策略奠定了重要基础。通过揭示晶体尺寸依赖性的焦亡诱导机制，该研究为肾结石的精准防治开辟了新的研究方向。
