Nannochloropsis sp. G1-5甲醇提取物通过抑制iNOS/COX-2通路发挥抗炎作用

《Phycology》：Exploring the Anti-Inflammatory Potential of Nannochloropsis sp. Extract

本研究探讨了Nannochloropsis sp. G1-5（NG15）甲醇提取物的抗炎潜力。该提取物富含类胡萝卜素、多不饱和脂肪酸（PUFAs）及酚类/黄酮类化合物。实验表明，NG15提取物在1 mg/mL浓度下对RAW 264.7巨噬细胞无毒性，并能剂量依赖性地抑制LPS诱导的一氧化氮（NO）产生，最高抑制率达81%。机制研究表明，NG15通过下调iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的mRNA表达，从而发挥抗炎作用，为开发新型抗炎剂提供了理论依据。

　　

1. 引言

炎症是机体应对物理创伤、有毒物质暴露、微生物入侵和组织损伤等刺激而激活的一种关键宿主防御机制。作为先天免疫系统的重要组成部分，炎症由受损组织和浸润免疫细胞释放的各种化学介质触发。然而，当炎症反应过度或无法消退时，会转变为慢性状态，导致各种病理状况的发生。

巨噬细胞在先天免疫反应的启动中起着核心作用。被激活后，这些细胞会吞噬入侵的微生物，并分泌一系列促炎介质，包括血管活性胺、花生四烯酸衍生物、细胞因子、血小板活化因子、一氧化氮（NO）和活性氧。NO由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成，NOS存在三种亚型：神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）。其中，iNOS在脂多糖（LPS）和促炎细胞因子等刺激下被强烈诱导表达。过量的NO会迅速与超氧化物反应生成过氧亚硝酸盐，这是一种强氧化剂，与细胞损伤、氧化应激、癌变和慢性炎症疾病密切相关。

脂多糖（LPS）通过结合Toll样受体4（TLR4），激活NF-κB和STAT3信号通路，进而导致iNOS、环氧合酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的转录上调。这些介质在类风湿性关节炎、纤维肌痛、干燥综合征等慢性免疫相关疾病的炎症反应中起着关键作用。环氧合酶在调节前列腺素生物合成中至关重要，其中COX-1维持生理稳态，而COX-2在炎症过程中被迅速诱导，促进前列腺素E2（PGE2）和其他前列腺素的产生，从而加剧疼痛、发热和水肿。

非甾体抗炎药（NSAIDs）和皮质类固醇被广泛用于治疗炎症性疾病，但其疗效常因胃肠道损伤、肝毒性、肾毒性、免疫抑制和代谢并发症等副作用而受限。因此，探索能够抑制NO和PGE2产生、下调iNOS和COX-2表达并调节上游炎症调节因子的天然化合物等更安全的替代品具有重要意义。

微藻因其富含类胡萝卜素、酚类化合物、多不饱和脂肪酸和其他具有抗氧化和抗炎活性的生物活性代谢物，而日益被视为重要的生物资源。Nannochloropsis属微藻尤其以其高含量的二十碳五烯酸（EPA）、紫黄质和其他叶黄素而著称，这些代谢物已被证明能够减少NO和PGE2的产生，抑制促炎细胞因子，并影响核因子κB（NF-κB）和信号转导与转录激活因子（STAT）相关通路。

本研究旨在分析Nannochloropsis sp. G1-5（NG15）甲醇提取物的生化组成，包括类胡萝卜素、脂肪酸和酚类化合物，并进一步通过评估其对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中NO产生和炎症相关介质表达的影响，来检验该提取物的抗炎潜力。

2. 材料与方法

2.1. 微藻物种的培养

微藻菌株Nannochloropsis sp. G1-5（NG15）在改良的F/2培养基中培养，该培养基含有两倍浓度的主要常量营养素NaNO₃和NaH₂PO₄·2H₂O。细胞在1 L锥形瓶中于300 mL培养基中培养10天，培养条件为：115 rpm振荡、80 μmol光子/m²/s连续光照、23°C、5% CO₂。随后，将细胞转移到补充有额外27 g/L NaCl的改良F/2培养基中，以诱导盐胁迫，并在相同的物理化学条件下再培养20天。通过离心收集细胞沉淀，并立即在-80°C下保存。

2.2. NG15提取物的制备

将30 mL培养物获得的冷冻细胞沉淀用15 mL无水甲醇提取，在室温下以最大速度涡旋15分钟，重复两次。将所得上清液通过PTFE注射器过滤器（0.2 μm孔径）以去除残留的细胞碎片。滤液使用离心蒸发器浓缩至干燥，获得55.8 mg干燥的NG15提取物，在细胞处理前用乙醇重悬至所需浓度。

2.3. 类胡萝卜素和脂肪酸甲酯的分析

使用配备Horizon C18/PFP柱的HPLC系统分析NG15粗提物中的类胡萝卜素。使用二元梯度系统，流动相A为甲醇:225 mM乙酸铵（82:18, v:v），流动相B为乙醇。使用二极管阵列检测器（300–720 nm）检测叶绿素a和类胡萝卜素。通过LC-MS分析进一步确认色素。使用气相色谱仪（GC）分析脂肪酸甲酯（FAME），通过酸催化酯交换反应制备FAME。

2.4. 总酚和总黄酮含量的测定

使用Folin–Ciocalteu比色法测定总酚含量（TPC），以没食子酸为标准品，结果表示为mg没食子酸当量（GAE）/g干重（DW）。使用氯化铝比色法测定总黄酮含量（TFC），以槲皮素为标准品，结果表示为mg槲皮素当量（QE）/g DW。

2.5. 细胞培养和活力测定

RAW 264.7巨噬细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养。将细胞以1.5 × 10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板中，孵育24小时后，在无血清培养基中用NG15提取物处理72小时。使用WST-1法评估细胞活力。

2.6. NO产生测定

将RAW 264.7巨噬细胞以5 × 10⁵个细胞/mL的密度接种于96孔板中，用提取物（0、0.25、0.5和1 mg/mL）预处理1小时。随后加入终浓度为1 μg/mL的脂多糖（LPS），再孵育24小时。取150 μL培养上清液与等体积的Griess试剂混合，室温孵育30分钟后，在548 nm处测量吸光度，并使用亚硝酸钠标准曲线定量亚硝酸盐水平。

2.7. 对iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6表达的抑制作用

将RAW 264.7细胞以1 × 10⁶个细胞/孔的密度接种于6孔板中，孵育24小时。用提取物（0、0.25、0.5和0.75 mg/mL）预处理1小时，然后用LPS（1 μg/mL）刺激24小时。收集细胞，提取总RNA，合成cDNA。使用基因特异性引物和SYBR Green qPCR预混液进行qRT-PCR。使用2^?ΔΔCT方法计算差异表达，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因进行标准化。

2.8. 统计分析

所有数据均表示为至少三次独立实验的平均值和标准差。使用Excel进行配对Student t检验，p值< 0.05被认为具有统计学显著性。

3. 结果与讨论

3.1. NG15甲醇提取物的生化组成

NG15甲醇提取物显示出独特的色素组成，包含六种类胡萝卜素：紫黄质、虾青素、玉米黄质、Vaucheriaxanthin酯、角黄素和β-胡萝卜素。其中虾青素和β-胡萝卜素的含量分别为0.46 mg/g提取物和0.38 mg/g提取物，其次是紫黄质（0.27 mg/g）、角黄素（0.26 mg/g）、Vaucheriaxanthin酯（0.18 mg/g）和玉米黄质（0.05 mg/g）。这种色素分布模式与先前关于Nannochloropsis物种的研究报道相似。在环境胁迫下，这些微藻通常会积累紫黄质、虾青素、β-胡萝卜素、角黄素和Vaucheriaxanthin作为主要的胡萝卜素和叶黄素。紫黄质已被报道具有抗氧化、抗炎和抗人癌细胞增殖的活性。β-胡萝卜素已知具有抗氧化和抗炎活性，可抑制NF-κB和MAPKs等关键炎症通路。此外，角黄素和虾青素也以其强大的抗氧化能力而闻名。这些结果表明，多种类胡萝卜素协同作用，增强了提取物的抗氧化和抗炎潜力。

此外，NG15甲醇提取物表现出高水平的酚类和黄酮类化合物，总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）分别为16.76 ± 1.0 mg GAE/g提取物和6.50 ± 0.57 mg QE/g提取物。酚类化合物以其清除自由基和螯合金属的特性而闻名。黄酮类化合物则以其提供氢原子和共振稳定能力而著称，有助于中和自由基和抑制氧化应激。NG15提取物还含有多种脂肪酸，包括亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和EPA等多不饱和脂肪酸（PUFAs），这些脂肪酸已知具有抗衰老和抗炎活性。因此，酚类和黄酮类化合物的共存表明存在一种互补的亲水性抗氧化系统，可能与已鉴定的PUFAs和脂溶性类胡萝卜素协同作用。

3.2. NG15提取物对细胞活力和LPS诱导的RAW 264.7细胞NO产生的影响

NG15甲醇提取物在0至1 mg/mL的浓度范围内对RAW 264.7巨噬细胞未表现出细胞毒性。这些结果表明，在实验条件下，该提取物对巨噬细胞具有生物相容性和无毒性。在LPS（1 μg/mL）刺激下，亚硝酸盐积累显著增加至47.8 μM，反映了LPS刺激引起的炎症反应导致NO产生增强。然而，与NG15提取物共处理显著且剂量依赖性地将亚硝酸盐水平降低至9.1 μM，表明其对LPS刺激的巨噬细胞中NO合成具有强烈的抑制作用。这些结果表明，NG15提取物有效抑制了iNOS的活性，iNOS是炎症期间NO过度产生的关键酶。细胞活力的维持和亚硝酸盐水平的降低同时发生，突显了NG15甲醇提取物具有选择性的抗炎潜力，它能在不诱导细胞毒性的情况下减轻炎症信号传导。

3.3. NG15提取物对iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响

NG15甲醇提取物显著抑制了LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中关键炎症介质的mRNA表达，包括iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6。使用1 μg/mL的LPS导致这些基因的转录与未刺激的对照组相比显著增加，证实了炎症反应的激活。相反，NG15提取物处理导致这些基因的表达显著且剂量依赖性地降低。在提取物浓度为0.75 mg/mL时，TNF-α和IL-6的表达水平分别降至30%和20%以下，表明促炎细胞因子的产生显著减少。

这些结果表明，NG15甲醇提取物通过同时抑制上游细胞因子产生和下游参与NO及前列腺素生物合成的效应酶，来减轻巨噬细胞驱动的炎症。iNOS和COX-2的下调表明该提取物降低了NO的水平，而NO是炎症和氧化应激的关键介质。这种抑制作用与NG15提取物处理减少NO的结果一致，也与先前的研究发现一致，即Nannochloropsis来源的提取物可缓解氧化和炎症应激。这些结果进一步支持了NG15提取物中的类胡萝卜素和酚类化合物协同作用以抑制炎症的观点。

对炎症介质的选择性抑制且无细胞毒性效应，表明该提取物通过调节机制而非破坏性机制来调节免疫反应。这一特性将NG15提取物与合成抗炎剂区分开来，后者通常诱导细胞应激或非特异性抑制。NG15甲醇提取物具有由类胡萝卜素、PUFAs、酚类和黄酮类化合物组成的均衡的抗氧化谱，这支持了NG15作为一种多功能生物资源的潜力，可用于化妆品和营养保健品领域，旨在减轻光氧化损伤和炎症相关的细胞反应。因此，NG15提取物在酶和细胞因子水平上有效调节炎症反应。总体而言，我们的结果支持NG15甲醇提取物作为一种无细胞毒性、天然来源的抗炎剂的潜力，在生物医学和药妆领域具有广阔的应用前景。

4. 结论

在本研究中，我们研究了NG15甲醇提取物的抗炎潜力。NG15提取物由类胡萝卜素、PUFAs、酚类和黄酮类化合物组成，这些物质已知具有抗氧化和抗炎活性。我们发现，NG15提取物在不产生细胞毒性的情况下，显著抑制了LPS刺激的巨噬细胞中一氧化氮（NO）的产生，并通过同时抑制上游细胞因子产生和下游参与NO及前列腺素生物合成的效应酶，来减轻炎症信号传导。我们的结果表明，NG15在开发具有生物医学和药妆应用前景的抗炎剂方面具有巨大潜力。