《Genes》：Molecular Tools for qPCR Identification and STR-Based Individual Identification of Panthera pardus (Linnaeus, 1758)
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本文开发并验证了一套结合多重实时荧光定量PCR（qPCR）与短串联重复序列（STR）的分子工具，用于濒危物种豹（Panthera pardus）的快速、特异性检测及个体识别。该体系针对线粒体细胞色素b（Cyt b）基因实现物种确认，结合核基因（PLP）进行DNA定量，并整合内部阳性对照（IPC）监控抑制，灵敏度高达1 pg/μL。同时，利用18个STR位点成功构建了30个豹个体的唯一DNA档案。该工具为打击野生动物犯罪及保护生物学研究提供了强有力的技术支撑。
1. 引言
豹（Panthera pardus）作为顶级捕食者，其分布范围横跨非洲和亚洲，目前被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录I，并被世界自然保护联盟（IUCN）列为易危物种。尽管该物种具有广泛的地理分布和生态适应性，但其种群数量正经历着严重的下降，这主要归因于栖息地丧失、人兽冲突以及非法贸易等多重压力。特别是非法贸易，已成为豹生存的主要威胁之一，其骨骼常被用作虎骨的替代品进入传统医药市场，皮毛、爪牙等也被广泛交易。
传统的物种和个体识别方法，如形态学特征识别，在处理高度加工或降解的野生动物制品时往往无能为力。因此，开发快速、可靠的分子工具对于保护生物学研究和法医学调查至关重要。实时荧光定量PCR（qPCR）技术因其快速、灵敏和成本效益高的特点，已成为野生动物法医学中物种检测的有力工具。然而，现有的豹特异性检测方法存在一些局限性，如缺乏DNA定量功能、未包含抑制对照，或扩增片段过大不适用于降解样本。
本研究旨在开发并验证一套集成的分子工具，通过多重qPCR技术实现豹的物种特异性检测和DNA定量，并利用短串联重复序列（STR）系统进行个体识别，为打击野生动物犯罪和豹的保护管理提供坚实的技术支持。
2. 材料与方法
2.1. 分析样本
研究共使用了30个豹（Panthera pardus）个体的样本（18雌12雄），主要来源为毛发。此外，为了测试特异性，研究还纳入了18种猫型亚目（Feliformia）物种以及两个外群物种（智人Homo sapiens和家犬Canis lupus familiaris）的样本。所有样本均来自捷克动物园和捷克环境监察局，严格遵守动物保护法规，未对动物造成伤害。
2.2. 定量系统与物种鉴定（Ppar Qplex）
研究团队设计了一个名为Ppar Qplex的多重qPCR检测体系。该体系包含三个靶标：
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物种特异性靶标：针对豹线粒体细胞色素b（Cyt b）基因的164 bp片段，用于确认豹的存在。
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核DNA靶标：针对猫型亚目物种保守的蛋白脂质蛋白（PLP）基因的132 bp片段，用于DNA定量。
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内部阳性对照（IPC）：一个261 bp的人工合成片段，用于监控PCR反应是否受到抑制。
该体系在QuantStudio? 5实时荧光定量PCR系统上进行，每个反应均包含阳性对照、阴性对照和特异性测试样本，并设置技术重复以确保结果的可重复性。
2.3. Ppar Qplex的验证
该检测体系经过了全面的验证，包括：
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稳健性：通过改变退火温度（±2°C）来评估。
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特异性：在20个物种（18个猫型亚目和2个外群）中进行测试。
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灵敏度：使用豹DNA的系列稀释液（1 pg/μL至1 ng/μL）进行评估。
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重复性：使用4个豹个体样本进行三次重复检测。
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再现性：由两名实验室技术人员独立操作同一批样本进行验证。
2.4. STRplex设计与个体识别
个体识别采用基于已发表的虎（Panthera tigris）和狮（Panthera leo）STR面板的复合扩增体系。该体系包含18个STR位点和一个性别鉴定系统。扩增产物通过毛细管电泳在SeqStudio? 3200遗传分析仪上进行分离，并使用GeneMapper v5软件进行基因分型分析。
3. 结果
3.1. 定量与物种鉴定
Ppar Qplex检测体系成功实现了对豹样本的物种鉴定和DNA定量。在豹样本中，线粒体Cyt b靶标（红色曲线）、核PLP靶标（蓝色曲线）和IPC（绿色曲线）均出现扩增信号。而在狮样本中，仅观察到核PLP和IPC的扩增，线粒体靶标无扩增，证明了该体系的高特异性。
3.2. Ppar Qplex验证结果
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稳健性：在退火温度60°C ± 2°C范围内，所有靶标均能成功扩增。
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特异性：线粒体靶标仅在豹样本中扩增，核靶标在所有18个猫型亚目物种中均扩增，而在外群物种中无扩增。
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灵敏度：该体系能够检测到低至1 pg/μL的豹DNA，并且在1 pg/μL至1 ng/μL的浓度范围内均能稳定扩增。
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重复性与再现性：所有重复检测和不同操作者之间的结果均保持一致，证明了该方法的可靠性和稳定性。
3.3. 个体识别
利用18个STR位点，研究成功获得了30个豹个体的唯一DNA档案。分析发现，有4个STR位点（Ptig15, Ptig18, Ptig8, Ptig11）在所测试的豹群体中呈单态性。此外，斯里兰卡豹（P. p. kotiya）亚种在另外两个位点（Ptig6, Pleo2）上也表现出单态性，这反映了该亚种因地理隔离导致的遗传多样性降低。研究还发现，豹在Ptig8位点的等位基因6.1与虎的等位基因7相比，在3'侧翼区存在一个单碱基插入，这一发现有助于区分这两个物种。
4. 讨论
本研究开发的Ppar Qplex检测体系解决了野生动物法医学中面临的关键挑战。该体系不仅能够对豹进行物种特异性检测，还能对样本中的DNA进行精确定量，并监控PCR抑制，这对于处理低质量或降解的样本至关重要。与以往仅依赖物种特异性扩增的方法相比，该体系在特异性和灵敏度方面均表现出色。
同时，研究证实了虎和狮的STR复合扩增体系在豹中同样具有适用性。这种跨物种的通用性极大地简化了实验室工作流程，使其能够在不预先知道物种来源的情况下对样本进行分析，这在处理来源不明的非法野生动物制品时具有重要价值。尽管部分STR位点在豹中表现出单态性，但这并不影响其个体识别能力，反而为研究不同亚种或地理种群的遗传多样性提供了线索。
5. 结论
本研究成功开发并验证了一套集成的分子工具，该工具结合了多重qPCR和STR技术，能够对豹进行快速、灵敏、特异的物种鉴定和个体识别。这套工具不仅为打击野生动物犯罪提供了强有力的法医学证据，也为豹的保护生物学研究和种群管理提供了关键数据，最终将有助于该濒危物种的生存和恢复。
