《ImmunoTargets and Therapy》：Flow Cytometric Profiling of Peripheral Immune Checkpoints Predicts Prognosis and Reveals PD-1/Treg/IL-10 Crosstalk in B-Cell Lymphoma
Abstract
Background
B细胞淋巴瘤中免疫检查点（ICs）的临床意义和机制作用仍未得到充分探索。本研究调查了外周免疫检查点表达作为预后生物标志物的价值及其与调节性T细胞（Treg）和白细胞介素-10（IL-10）的相互作用。
Methods
研究人员采集了140例B细胞淋巴瘤患者的外周血样本，使用流式细胞术分析了CD4+和CD8+T细胞上的程序性死亡蛋白-1（PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（CTLA-4）、淋巴细胞激活基因-3（LAG-3）和T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3（TIM-3）的表达，并采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测了IL-10水平。研究比较了不同疾病侵袭性、结外受累情况以及治疗反应（完全缓解[CR] vs 复发/进展[R/P]）患者之间的差异。
Results
研究结果显示，侵袭性淋巴瘤和有多发结外受累部位的病例，其免疫检查点表达水平显著升高。与达到完全缓解的患者相比，复发/进展期患者的PD-1表达显著更高（CD4+T细胞：26.1% vs 8.2%；CD8+T细胞：25.2% vs 7.1%），CTLA-4、LAG-3和TIM-3的表达也更高。PD-1和CTLA-4显示出显著的预后价值（曲线下面积AUC > 0.7），而LAG-3和TIM-3的预测效能较差。复发/进展期患者的外周血Treg比例（7.84% vs 3.58%）和IL-10水平（10.5 vs 5.44 pg/mL）均显著升高。CD4+T细胞上的PD-1表达与Treg频率（r = 0.539）和IL-10水平（r = 0.457）均呈正相关。
Conclusion
研究表明，外周T细胞免疫检查点，特别是PD-1和CTLA-4，是B细胞淋巴瘤重要的预后生物标志物。PD-1+CD4+T细胞与Treg扩增和IL-10水平升高的相关性，提示PD-1信号可能通过促进Treg分化和激活JAK2/STAT3通路来诱导免疫抑制，这为治疗靶向提供了新的见解。
Introduction
B细胞淋巴瘤是一种与B细胞生长、发育和活化相关的复杂分子通路密切相关的血液系统恶性肿瘤。肿瘤免疫微环境的失调是该疾病关键的致病机制之一。研究B细胞淋巴瘤患者的免疫微环境，探索免疫检查点、调节性T细胞和IL-10信号之间的相互作用，可以阐明肿瘤免疫逃逸机制，同时为预后评估和治疗指导提供生物标志物。
免疫检查点，也称为共抑制受体，其主要功能是抑制T细胞活性并诱导T细胞耗竭。它们包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3及其各自的配体。免疫检查点抑制剂（ICIs）在癌症治疗中引起了广泛关注。然而，CTLA-4抑制剂由于其高毒性和众多副作用，在临床实践中很少使用。相比之下，PD-1/PD-L1抑制剂已在临床上广泛应用，但仅有一部分患者能从这些治疗中获益，其总体疗效仍不理想。尽管新的免疫检查点抑制剂药物和临床应用不断涌现，但迫切需要更深入地了解免疫检查点分子的复杂生物学特性，并揭示B细胞淋巴瘤患者中免疫检查点表达与疾病发生、进展和预后的相关性。
本研究通过两种综合方法系统地研究了外周免疫检查点分析在B细胞淋巴瘤中的临床意义：首先，通过将循环T细胞免疫检查点（CTLA-4、LAG-3、PD-1和TIM-3）的表达模式与疾病进展和治疗结果相关联，确立其预后价值；其次，探索这些检查点、调节性T细胞和IL-10信号之间潜在的相互作用，这些相互作用可能有助于形成免疫抑制性肿瘤微环境——这是淋巴瘤免疫生物学中的一个关键知识空白，具有直接的治疗意义。
Materials and Methods
Study Subjects
本研究纳入了140例符合世界卫生组织（WHO）分类标准的B细胞淋巴瘤患者。纳入标准包括：确诊为B细胞淋巴瘤；年龄在25至90岁之间。排除标准包括：患有自身免疫性疾病；患有其他恶性肿瘤；存在凝血功能障碍；入组时有活动性感染；正在接受免疫抑制治疗；既往接受过免疫检查点抑制剂治疗。所有用于流式细胞术和ELISA分析的样本均在开始任何系统性治疗前采集。共有30例完全缓解组患者和41例复发/进展组患者分析了外周血Treg和IL-10。为了排除侵袭性和惰性淋巴瘤对Treg的影响，研究人员进一步分析了71例样本中惰性B细胞淋巴瘤（滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的完全缓解组和复发/进展组之间外周血Treg和IL-10水平的差异。惰性B细胞淋巴瘤的完全缓解组和复发/进展组各包括12例患者，而DLBCL的完全缓解组和复发/进展组分别包括18例和29例患者。本研究遵循世界医学协会《赫尔辛基宣言》的指南，研究方案经大连医科大学附属第二医院伦理委员会批准，并获得每位参与者的书面知情同意。
Flow Cytometry
研究人员在采集后2小时内从4 mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝静脉血中分离出外周血单个核细胞（PBMCs）。细胞在4°C避光条件下与荧光染料标记的单克隆抗体孵育30分钟，抗体针对CD3、CD4、CD8、PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3。使用1×氯化铵溶液在室温下裂解红细胞15分钟后，用含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并在BD FACSCanto II流式细胞仪上获取数据。淋巴细胞群的详细设门策略见补充图。数据使用FlowJo v10.8软件进行分析。对于调节性T细胞的计数，遵循相同的程序，但抗体面板针对CD4、CD25和CD127，并且红细胞裂解步骤采用更温和的1000 g离心15分钟，之后将细胞重悬于300 μL缓冲液中，收集事件用于设门分析CD4+CD25+CD127?/lowTreg。
Enzyme?Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
使用人IL-10 Quantikine ELISA试剂盒按照制造商方案定量血浆IL-10浓度。血浆从4 mL新鲜EDTA或肝素抗凝外周血经300g离心5分钟分离后，于-80°C保存直至分析。在试剂准备后，将100μL IL-10标准品或适当稀释的样品加入96孔微孔板的复孔中，用粘性膜密封并在36°C孵育90分钟。然后揭膜，弃去内容物并拍干，每个孔加入洗涤缓冲液，静置20秒后完全去除液体，重复此过程五次。向每孔加入100微升生物素化抗人IL-10抗体，将板在36°C孵育60分钟，之后重复洗涤循环五次。向每孔中加入100μL链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物，将板在20–25°C孵育30分钟，然后再洗涤五次。然后加入含有四甲基联苯胺（TMB）的底物溶液（100 μL），将板在20–25°C避光放置10–20分钟，直至颜色发育最佳。用50μL终止液终止反应，并立即在SpectraMax iD3酶标仪上于450nm波长下读取吸光度值，并使用540nm进行校正。
Statistical Analysis
使用SPSS 25.0软件进行数据分析。符合正态分布的数据采用t检验进行分析，以均数±标准差表示。非正态分布的数据采用非参数检验进行分析，以中位数（范围）表示。使用GraphPad Prism 9.5软件进行数据可视化。P值< 0.05被认为具有统计学显著性。使用受试者工作特征（ROC）曲线进一步评估和验证评分系统的预测性能，以曲线下面积（AUC）作为性能衡量指标。AUC > 0.7被认为具有良好的预测性能。
Results
Analysis of Circulating T-Cell Immune Status in Patients with Newly Diagnosed B-Cell Lymphoma
使用流式细胞术评估了新诊断的侵袭性和惰性B细胞淋巴瘤患者外周血CD4+和CD8+T细胞上PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3的表达。结果显示，与惰性组相比，侵袭性B细胞淋巴瘤患者循环CD4+和CD8+T细胞上所有评估的免疫检查点的表达水平均显著升高。这在PD-1上最为明显，其在侵袭性组中显示出显著增加。同样，CTLA-4、LAG-3和TIM-3在两种T细胞亚群中的表达也显著更高。
Analysis of Circulating T-Cell Immune Status in Patients with Newly Diagnosed B-Cell Lymphoma with or Without Extensive Involvement
使用流式细胞术评估了新诊断的B细胞淋巴瘤患者中仅有单个/无结外受累和有多发结外受累的患者外周血CD4+和CD8+T细胞上PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3的表达。结果显示，与仅有单个/无结外受累的患者相比，有多发结外受累的患者CD4+和CD8+T细胞上所有四种免疫检查点（PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3）的表达均出现显著且一致的增加。
Analysis of Circulating T-Cell Immune Status in Patients with Newly Diagnosed B-Cell Lymphoma with Good or Poor Prognosis
使用流式细胞术评估了B细胞淋巴瘤治疗后达到完全缓解（CR）和复发或疾病进展（R/P）的患者外周血CD4+和CD8+T细胞上PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3的表达。结果显示，与达到完全缓解的患者相比，复发或疾病进展患者循环CD4+和CD8+T细胞上所有评估的免疫检查点的表达均显著升高。这在PD-1和CTLA-4上最为明显，其在复发/进展组中显示出显著增加。同样，LAG-3和TIM-3在两种T细胞亚群中的表达也显著更高。
Validation of the Prognostic Prediction Efficacy of Immune Checkpoints in Patients with Newly Diagnosed B-Cell Lymphoma
为了验证新诊断B细胞淋巴瘤患者循环T淋巴细胞上免疫检查点的预后预测效能，进一步构建了ROC曲线。结果显示，CD4+T细胞上PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3的AUC值分别为0.859、0.828、0.625和0.634。对于CD8+T细胞，PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3的AUC值分别为0.794、0.767、0.618和0.601。总之，循环T细胞上的PD-1和CTLA-4在预测B细胞淋巴瘤患者预后方面表现出良好的效能，而循环T细胞上的LAG-3和TIM-3未显示出良好的预测效能。
Analysis of Circulating Tregs in Peripheral Blood of B-Cell Lymphoma Patients with Good or Poor Prognosis
使用流式细胞术测量了完全缓解组和复发/进展组患者外周血中Treg的比例。结果显示，复发/进展组患者外周血Treg比例高于完全缓解组。为了排除侵袭性和惰性淋巴瘤对Treg的影响，研究人员进一步分析了惰性B细胞淋巴瘤和DLBCL患者完全缓解组和复发/进展组的外周血Treg比例。结果显示，在惰性B细胞淋巴瘤患者中，复发/进展组的Treg比例高于完全缓解组。在DLBCL患者中，复发/进展组的Treg比例也高于完全缓解组。
Comparison of Peripheral Blood IL-10 Levels in B-Cell Lymphoma Patients with Good or Poor Prognosis
使用ELISA法测量了完全缓解组和复发/进展组患者外周血中IL-10的水平。结果显示，复发/进展组患者外周血IL-10浓度高于完全缓解组。为了排除侵袭性和惰性淋巴瘤对IL-10的影响，研究人员进一步分析了惰性B细胞淋巴瘤和DLBCL患者完全缓解组和复发/进展组的外周血IL-10浓度。结果显示，在惰性B细胞淋巴瘤患者中，复发/进展组的IL-10浓度高于完全缓解组。在DLBCL患者中，复发/进展组的IL-10浓度也高于完全缓解组。
Correlation Analysis of Tregs, IL-10, and T-Cell Immune Status in Peripheral Blood of Patients with B-Cell Lymphoma
对B细胞淋巴瘤患者外周血中Treg、IL-10水平以及T细胞上免疫检查点表达水平进行了Spearman相关分析。结果显示，Treg与CD4+T细胞上PD-1的表达呈正相关，而Treg与其他免疫检查点之间未观察到显著相关性。类似地，IL-10与CD4+T细胞上PD-1的表达也呈正相关，而IL-10与其他免疫检查点之间未观察到显著相关性。
Discussion
本研究提供了令人信服的证据，表明B细胞淋巴瘤中T细胞上的外周免疫检查点表达与Treg频率、IL-10水平和临床结果相关，揭示了一个驱动疾病进展的关键免疫抑制轴。这些发现不仅强调了PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3的预后意义，而且阐明了T细胞耗竭、调节性T细胞扩增和IL-10介导的免疫抑制之间的机制联系。
侵袭性B细胞淋巴瘤患者循环CD4+和CD8+T细胞上免疫检查点表达升高，这与T细胞耗竭作为血液恶性肿瘤免疫逃逸标志的认识日益增长相一致。值得注意的是，侵袭性疾病患者和有多发结外受累的患者CD4+T细胞上的PD-1表达显著更高，这加强了其与晚期疾病生物学的关联。这一观察结果与先前在DLBCL中的研究一致，该研究中PD-1和TIM-3的上调与B症状和乳酸脱氢酶（LDH）升高等高风险特征相关。我们的数据通过证明外周免疫检查点表达反映了肿瘤微环境耗竭，扩展了这些发现，为风险分层提供了一种微创生物标志物。
B细胞淋巴瘤的肿瘤微环境（TME）由细胞成分和免疫抑制分子组成，共同促进肿瘤免疫逃逸。Treg和肿瘤细胞都分泌IL-10，IL-10促进肿瘤细胞上程序性死亡配体-1（PD-L1）的表达，并有助于T细胞耗竭。IL-10/IL-10受体（IL-10R）通路也很重要——IL-10R在PD-1highCD8+T细胞上表达上调，并且IL-10可诱导抗原特异性PD-1highCD8+T细胞凋亡。双重阻断IL-10R/PD-1可增强肿瘤特异性CD8+T细胞的扩增和功能。
为了阐明免疫检查点在B细胞淋巴瘤中的作用，我们分析了外周Treg频率、IL-10水平与检查点表达之间的相关性。Treg频率与CD4+T细胞上的PD-1呈正相关，IL-10水平也是如此。未检测到其他显著相关性。基于这些发现和现有文献，我们提出一个模型：肿瘤来源的IL-10激活JAK2/STAT3信号并上调PD-L1。PD-L1/PD-1相互作用可能驱动CD4+T细胞耗竭并促进其向Treg分化，而Treg又分泌更多IL-10，形成一个前馈循环，加剧T细胞耗竭和肿瘤增殖。因此，Treg、IL-10和免疫检查点似乎相互作用，抑制抗肿瘤 immunity 并促进B细胞淋巴瘤的免疫逃逸。基于我们先前发现的IL-10通过B细胞受体（BCR）-NFATc1/STAT3信号在DLBCL中上调PD-L1，目前的发现在临床上验证了这一轴，并将PD-1+CD4+T细胞确定为肿瘤相关免疫抑制的主要调节因子。
我们数据的预后意义尤其显著。与完全缓解的患者相比，复发或疾病进展患者的CD4+和CD8+T细胞上的PD-1和CTLA-4表达显著更高。ROC分析进一步证实了PD-1和CTLA-4的强大预测价值，表明它们可作为监测治疗反应和早期复发检测的动态生物标志物。这些结果补充了新兴的证据，即外周血中的免疫检查点表达可能作为肿瘤微环境耗竭的替代指标，为临床决策提供实用工具。
Treg、IL-10和免疫检查点之间的相互作用也具有重要的治疗意义。虽然PD-1阻断在B细胞淋巴瘤中显示出前景，但由于代偿性免疫抑制机制，缓解率仍然不理想。我们的数据表明，双重靶向PD-1和IL-10/IL-10R信号可以破坏免疫抑制反馈环，可能增强T细胞功能并改善临床结果。临床前研究支持这种方法，证明IL-10R阻断与抗PD-1疗法协同作用，使耗竭的CD8+T细胞恢复活力。类似地，清除或抑制Treg的策略（例如，抗CCR4抗体）可能通过减轻IL-10介导的抑制来进一步增强检查点抑制的效果。
尽管有这些进展，仍有一些问题尚未解决。本研究表明，LAG-3/TIM-3表达与IL-10缺乏相关，并且在外周血中显示出有限的预后预测价值（如ROC和相关分析所示），这表明免疫检查点分子可能发挥不同的作用。PD-1/CTLA-4可能主导全身性T细胞耗竭，而LAG-3/TIM-3的功能可能局限于肿瘤微环境，发挥局部效应。未来的单细胞分析和空间转录组学分析将有助于破译这些区室化的相互作用。此外，我们研究的回顾性设计需要在更大的前瞻性队列中进行验证，特别是探索惰性与侵袭性淋巴瘤的亚型特异性差异。
总之，我们的工作描绘了PD-1/Treg/IL-10轴在B细胞淋巴瘤免疫逃逸中的关键作用，为生物标志物驱动的免疫治疗提供了机制基础。通过将外周免疫检查点表达与肿瘤微环境失调联系起来，我们为整合液体活检方法与靶向治疗策略提供了路线图。未来探索同时靶向检查点抑制、Treg活性和IL-10信号组合方案的研究，可能为改善这种难治性疾病的免疫控制提供有希望的新途径。
Conclusions
我们的研究阐明了B细胞淋巴瘤中外周免疫检查点表达、Treg、IL-10与疾病进展之间的关键机制联系，对预后和治疗策略具有深远的临床意义。我们证明，循环CD4+和CD8+T细胞上PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3的表达升高与侵袭性疾病特征相关，包括晚期淋巴瘤、结外受累和不良治疗结果。值得注意的是，CD4+T细胞上的PD-1与Treg比例和IL-10水平呈强正相关，提示存在一个反馈环，其中PD-1信号可能促进Treg扩增和IL-10分泌，通过JAK2/STAT3通路进一步加剧免疫抑制和肿瘤进展。这些发现强调了外周免疫检查点作为非侵入性生物标志物用于风险分层和早期检测疾病复发的潜力。PD-1和CTLA-4的强大预测性能突出了它们在监测治疗反应和指导个性化免疫治疗中的效用。此外，我们的数据主张双重靶向PD-1和IL-10/IL-10R通路以破坏这一免疫抑制轴，为增强B细胞淋巴瘤免疫检查点阻断疗效提供了一种新颖的组合方法。
通过揭示免疫耗竭、Treg和IL-10之间的相互作用，这项研究有助于加深对该疾病免疫逃逸机制的理解，并为转化创新铺平了道路。未来的临床试验应在更大的队列中验证这些生物标志物，并探索同时调节检查点分子和细胞因子网络的治疗干预措施，以改善患者预后。我们的工作将外周免疫分析定位为B细胞恶性肿瘤精准医疗的基石，与临床实践和药物开发直接相关。
