《ImmunoTargets and Therapy》：Inhibitors of KAT2A Alleviate the Progression of AKI by Alleviating Macrophage Ferritinophagy
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本文揭示了组蛋白乙酰转移酶KAT2A通过调控NCOA4介导的巨噬细胞铁蛋白自噬（ferritinophagy）和cGAS-STING炎症信号通路，在急性肾损伤（AKI）中发挥关键作用。研究发现KAT2A特异性抑制剂MB-3可显著减轻小鼠肾脏缺血再灌注（I/R）损伤，为AKI治疗提供了新的潜在靶点。
Abstract
背景
急性肾损伤（AKI）涉及复杂的炎症反应，其中巨噬细胞功能障碍起着核心作用。尽管组蛋白乙酰转移酶KAT2A已被认为参与免疫调节，但其在AKI期间巨噬细胞铁蛋白自噬（ferritinophagy）中的作用仍不清楚。
方法
通过对小鼠肾脏组织进行单细胞RNA测序分析，发现在AKI进展过程中，肾脏巨噬细胞存在铁蛋白自噬的异常激活和KAT2A的上调。通过免疫荧光染色检测AKI样本肾脏巨噬细胞中FTH1和LAMP1的共定位，以及FTH1、NCOA4蛋白和KAT2A蛋白的荧光强度增加。在RAW264.7细胞系中使用KAT2A敲低和过表达质粒评估KAT2A对巨噬细胞铁蛋白自噬的功能影响。在IR术后24小时通过腹腔注射给予特异性KAT2A抑制剂丁内酯3（MB-3），以评估MB-3对肾脏病理变化和巨噬细胞铁蛋白自噬活性的影响。
结果
在本研究中，利用单细胞RNA测序和双重免疫荧光，我们观察到肾脏巨噬细胞中存在异常的铁蛋白自噬，其特征是FTH1与LAMP1和NCOA4的共定位增加，同时CD68表达升高。在人类AKI活检组织和小鼠模型的巨噬细胞中，KAT2A均表达上调。基因敲低KAT2A可抑制铁蛋白自噬，降低NCOA4和FTH1的表达，减少FTH1-LAMP1共定位，并抑制cGAS信号。相反，KAT2A过表达则加剧了这些过程。关键的是，沉默NCOA4消除了KAT2A驱动的铁蛋白自噬和cGAS-STING激活。使用MB-3进行KAT2A的药理学抑制能显著减轻肾损伤、巨噬细胞浸润和铁蛋白自噬，并减少KAT2A或NCOA4与F4/80的共定位。
结论
这些发现表明，KAT2A通过巨噬细胞中NCOA4介导的铁蛋白自噬和cGAS-STING炎症信号通路促进AKI进展，突显了KAT2A抑制作为AKI一种有前景的治疗策略。
引言
急性肾损伤（AKI），也称为急性肾功能衰竭，是一种以肾功能突然下降为特征的综合征，导致氮质血症、水和电解质紊乱、酸碱失衡及全身并发症。它发生在10-15%的住院患者中，并影响超过50%的ICU患者。AKI与高短期死亡率和严重的长期结局相关，例如进展为慢性肾脏病（CKD）和心血管事件风险增加。尽管支持治疗有所改进，但针对AKI基本病理生理学的靶向治疗仍然缺乏。因此，揭示关键分子机制并确定新的治疗靶点对于推进AKI的临床管理和改善结局至关重要。
巨噬细胞是高度可塑的免疫细胞，会根据环境信号发生背景依赖性极化，获得不同的功能表型。在急性肾损伤（AKI）中，巨噬细胞在疾病进展中起着关键作用。具体而言，促炎的M1巨噬细胞在AKI的初始阶段占主导地位。它们通过释放炎症细胞因子（如IL-6和TNF-α）、通过趋化因子（包括CCL2和CXCL1）招募中性粒细胞和单核细胞，以及产生细胞毒性活性氧（ROS）来导致组织损伤。相反，M2巨噬细胞在消退期通过胞葬作用、抗炎细胞因子分泌和促血管生成活动来促进组织修复。铁蛋白自噬是一种选择性自噬形式，通过货物受体NCOA4降解铁蛋白重链（FTH1），导致不稳定铁释放并维持细胞铁稳态。在生理条件下，铁蛋白自噬支持基本的细胞功能，如增殖和分化。然而，其病理性过度激活会导致铁过载、铁死亡（一种由脂质过氧化驱动的铁依赖性细胞死亡）并促进M1巨噬细胞极化。在AKI中，铁死亡已被确定为肾小管上皮细胞损伤的关键因素。然而，巨噬细胞铁蛋白自噬在AKI中的具体作用和调控机制仍知之甚少。
赖氨酸乙酰转移酶2A（KAT2A，也称为GCN5）是一种高度保守的组蛋白乙酰转移酶，通过其乙酰转移酶活性调节多种细胞过程，包括基因表达、代谢和炎症。在AKI中，KAT2A被认为通过组蛋白乙酰化促进炎症反应和细胞凋亡，从而促进疾病进展。新出现的证据表明，KAT2A在巨噬细胞极化和免疫代谢中也发挥作用。KAT2A通过对关键代谢调节因子进行乙酰化来调节巨噬细胞脂肪酸氧化和炎症信号。在脓毒症模型中，沉默KAT2A已被证明可以抑制M1极化和NLRP3激活，从而减轻心肌损伤。KAT2A通过代谢-表观遗传重编程促进类风湿性关节炎中炎症巨噬细胞的NLRP3炎性体激活，而KAT2A组蛋白乙酰转移酶抑制剂丁内酯3（MB-3）抑制H3K9ac修饰，增强NRF2与Il1b和Nlrp3启动子的结合，并抑制其转录。因此，KAT2A通过调节巨噬细胞炎症反应，代表了炎症相关疾病的潜在治疗靶点。然而，KAT2A是否通过表观遗传机制调节巨噬细胞铁蛋白自噬来影响AKI仍属未知。
材料与方法
本研究采用了单细胞RNA测序分析、人类临床样本（AKI患者和微小病变病对照的肾活检组织）、小鼠肾脏缺血再灌注（I/R）损伤模型、组织学评估（H&E、Masson三色、PAS染色）、细胞培养与转染（RAW264.7细胞系，进行KAT2A和NCOA4的敲低与过表达）、蛋白质印迹分析（检测KAT2A、GPX4、FTH1、NCOA4、cGAS、p-STING等蛋白表达）以及免疫荧光染色（检测蛋白定位与共定位）等方法。统计学分析使用SPSS 20.0软件进行。
结果
单细胞测序分析显示AKI进展中巨噬细胞铁蛋白自噬异常激活
小鼠肾脏组织的单细胞测序分析显示，与假手术对照组相比，I/R-AKI组小鼠肾脏组织中增加的巨噬细胞群体是Damage_Macro簇，减少的巨噬细胞群体是Normal_Macro簇。此外，单细胞测序的差异基因表达分析显示，与其他巨噬细胞簇相比，Damage_Macro簇中Ncoa4、Fth1和Map1lc3b基因的表达显著上调。免疫荧光染色结果也显示，I/R-AKI小鼠肾小管中FTH1和LAMP1的表达水平增加，并且两种蛋白的共定位也增强。
AKI患者肾脏中异常激活的巨噬细胞铁蛋白自噬的确定
对AKI患者肾活检样本中铁蛋白自噬相关蛋白的免疫荧光染色结果显示，AKI患者肾组织中FTH1和LAMP1的荧光强度增加且共定位增强，提示小管溶酶体中铁蛋白异常积累。随后，使用免疫荧光法对AKI肾活检组织中巨噬细胞标志物CD68分别与FTH1和NCOA4进行共染色。结果表明，AKI患者肾脏巨噬细胞中FTH1和NCOA4蛋白水平上调，并且肾脏中FTH1与CD68以及NCOA4与CD68的共定位增强。这些结果揭示了AKI期间肾脏巨噬细胞中异常的铁蛋白自噬诱导。
单细胞测序分析显示AKI状态下肾脏巨噬细胞中KAT2A表达上调
为了进一步探讨I/R-AKI小鼠巨噬细胞铁自噬过度激活的分子机制，重新分析了单细胞转录组测序结果中损伤巨噬细胞簇的特征。结果显示，Kat2a是Damage_Macro簇中高表达的标志基因。此外，通过免疫荧光法对巨噬细胞标志物CD68和KAT2A进行共染色，分别检测IR-AKI小鼠和临床AKI样本肾脏巨噬细胞中KAT2A的表达水平。结果显示，在IR-AKI小鼠和AKI患者的肾脏巨噬细胞中，KAT2A的表达水平显著增加。
KAT2A在体外促进巨噬细胞铁蛋白自噬
在细胞水平上进一步研究了KAT2A对巨噬细胞铁蛋白自噬的调节作用。用KAT2A敲低（KAT2A-KD）或过表达（KAT2A-OE）质粒瞬时转染RAW264.7细胞系，并通过蛋白质印迹法检测这些细胞中KAT2A、铁蛋白自噬相关蛋白（如FTH1、NCOA4、GPX4）以及cGAS信号相关蛋白（如cGAS、p-STING和STING）的表达水平。结果显示，在KAT2A-KD的RAW264.7细胞中，KAT2A、NCOA4、cGAS、p-STING/STING的表达水平下调，而FTH1和GPX4蛋白表达上调。然而，在KAT2A-OE的RAW264.7细胞中观察到相反的结果。此外，使用免疫荧光法检测KAT2A-KD和KAT2A-OE的RAW264.7细胞中FTH1和LAMP1蛋白的共定位。FTH1与LAMP1的共定位强度在KAT2A-KD细胞中减弱，但在KAT2A-OE细胞中增强，这与阳性对照Bafilomycin A1诱导的FTH1-LAMP1共定位增加一致。这些结果表明KAT2A过表达诱导巨噬细胞中铁蛋白自噬的激活。
敲低NCOA4抑制KAT2A对巨噬细胞的促炎作用
为了进一步探讨KAT2A调节巨噬细胞炎症反应的具体分子机制，观察了NCOA4敲低对过表达KAT2A的RAW264.7细胞炎症反应的影响。蛋白质印迹结果显示，在NCOA4敲低后，过表达KAT2A的RAW264.7细胞中cGAS和p-STING蛋白的表达水平被显著抑制。此外，通过免疫荧光染色探讨了NCOA4敲低对过表达KAT2A的RAW264.7细胞中FTH1和LAMP1共定位的影响。结果显示，NCOA4敲低后，RAW264.7细胞中FTH1和LAMP1的共定位信号显著减弱。这些结果表明KAT2A通过调节NCOA4介导的铁蛋白自噬参与促炎反应。
KAT2A抑制剂减轻IR-AKI小鼠的肾脏病理变化
为了进一步研究特异性KAT2A抑制剂丁内酯3（MB-3）是否能改善缺血再灌注损伤（IR）小鼠的肾脏病理，在IR后24小时通过腹腔注射给予MB-3。使用H&E（苏木精-伊红）、PAS（高碘酸-雪夫）和Masson三色染色等三重组织学染色评估肾脏病理变化。H&E染色结果显示，uIRI导致严重的肾小管损伤，包括广泛的上皮细胞水肿、胞质空泡化和刷状缘丢失，而MB-3治疗显著减轻了这些病理变化。PAS染色结果表明，uIRI诱导了局灶性肾小球基底膜增厚和肾小管上皮/管腔内糖原沉积增加，MB-3给药减少了糖原积累并保留了基底膜完整性。Masson染色结果显示，uIRI处理的小鼠出现轻度系膜胶原增生和间质纤维化，而MB-3处理的uIRI小鼠胶原沉积显著减少。这些结果提示KAT2A抑制剂可能对AKI进展具有潜在的缓解作用。
KAT2A抑制剂减轻IR-AKI小鼠肾脏巨噬细胞的炎症浸润和铁蛋白自噬
我们进一步通过免疫荧光染色探讨了KAT2A抑制剂对IR-AKI小鼠肾脏巨噬细胞炎症浸润和铁蛋白自噬的影响。uIRI处理使IR-AKI小鼠肾组织中KAT2A和F4/80蛋白的表达上调，而MB-3治疗后显著降低。与对照组相比，DMSO共处理的uIRI组巨噬细胞中NCOA4蛋白表达水平更高，表明在IR-AKI条件下肾脏巨噬细胞中铁蛋白自噬过度激活。相反，用KAT2A抑制剂MB-3治疗后，IR-AKI小鼠巨噬细胞中NCOA4的表达水平显著降低。这些数据表明KAT2A抑制剂能有效阻断IR-AKI进展中肾脏巨噬细胞的铁蛋白自噬激活。
讨论
我们的研究确定了KAT2A–NCOA4–铁蛋白自噬轴是驱动急性肾损伤（AKI）中巨噬细胞介导的肾脏炎症的一种新颖且关键的机制。通过结合人类样本的单细胞RNA测序、体外机制研究和干预性动物模型的综合方法，我们证明：（1）在AKI期间，肾脏巨噬细胞中的铁蛋白自噬被显著激活；（2）KAT2A上调直接增强巨噬细胞中的铁蛋白自噬活性；（3）KAT2A的促炎功能依赖于NCOA4介导的铁蛋白自噬；（4）KAT2A的药理学抑制通过抑制巨噬细胞中的铁蛋白自噬和随后的炎症反应来改善肾损伤。
铁对于基本的生物过程至关重要，包括氧气运输、ATP合成和DNA代谢。虽然缺铁与贫血以及组织（如骨骼肌和心肌）的系统性功能障碍有关，但铁过载通过铁催化的自由基生成加剧氧化应激，导致诸如遗传性血色素沉着症等病理变化。因此，铁稳态的严格调控对于细胞和组织功能至关重要。铁蛋白自噬是一种由货物受体NCOA4介导的选择性自噬过程，降解铁蛋白以释放储存的铁并维持细胞内铁平衡。这个过程受细胞铁水平的动态调控。巨噬细胞通过吞噬红细胞、代谢血红蛋白和释放铁（提高局部和全身铁可用性）在全身铁循环中起关键作用。过量的铁促进M1巨噬细胞极化和炎症反应，这通过单核细胞浸润和促炎介质释放在缺血再灌注（I/R）损伤中导致肾损伤。
值得注意的是，新出现的证据表明NCOA4介导的铁蛋白自噬参与AKI的发病机制，尽管其巨噬细胞特异性作用仍不清楚。在本研究中，单细胞测序和铁蛋白与LAMP1的共定位揭示了AKI早期巨噬细胞中溶酶体铁蛋白降解增强，强调了铁蛋白自噬在驱动铁过载和炎症性巨噬细胞激活中的重要性。铁蛋白自噬受到翻译后调控。最近的研究表明，HERC2介导的NCOA4降解在调节铁蛋白自噬中起关键作用。
KAT2A是一种参与炎症和免疫调节的赖氨酸乙酰转移酶，先前已被证明与巨噬细胞介导的炎症有关。在本研究中，单细胞测序和免疫荧光染色揭示了I/R-AKI模型肾脏巨噬细胞中KAT2A表达上调，表明其在AKI期间加剧炎症反应的潜在作用。使用敲低和过表达方法，我们证明KAT2A促进巨噬细胞中NCOA4介导的铁蛋白自噬。此外，与先前报道KAT2A通过转录和翻译后机制在炎症背景下激活cGAS通路一致，我们的数据也表明KAT2A正向调节cGAS信号。重要的是，沉默NCOA4消除了KAT2A过表达诱导的促炎效应，确立了NCOA4作为一个关键的下游效应器。这些发现共同表明KAT2A通过增强巨噬细胞中的铁蛋白自噬来驱动AKI中的炎症反应。此外，作为一种组蛋白乙酰转移酶，KAT2A可能通过乙酰化NCOA4启动子上的H3K9来在转录上促进铁蛋白自噬，这一假设值得进一步研究。
在本研究中，KAT2A被确定为AKI（特别是在缺血再灌注模型）期间肾脏巨噬细胞中铁蛋白自噬过度激活和促炎极化的关键调节因子。为了评估靶向KAT2A的治疗潜力，我们研究了其选择性抑制剂MB-3在I/R诱导的AKI小鼠中的作用。MB-3竞争性地结合KAT2A的乙酰辅酶A位点，抑制其乙酰转移酶活性和随后的转录调控。病理染色和免疫荧光分析显示，MB-3治疗显著减轻了肾损伤、炎症浸润和巨噬细胞铁蛋白自噬。MB-3的抗炎作用与Liu等人先前的发现一致，支持其通过抑制巨噬细胞中的KAT2A-NCOA4-铁蛋白自噬轴来保护免受AKI的作用。虽然本研究初步证明药理学抑制KAT2A在I/R模型中改善了AKI进展，但应注意几个局限性。I/R模型虽然被广泛使用，并不能完全反映人类AKI的多因素病因。未来的研究应纳入额外的AKI模型——如顺铂诱导的肾毒性——以及具有代谢合并症的动物，以提高临床相关性。此外，由于MB-3抑制多种细胞类型的KAT2A，巨噬细胞特异性KAT2A的具体贡献仍有待阐明。构建巨噬细胞特异性KAT2A敲除小鼠将有助于阐明其功能的细胞自主机制。
结论
本研究确立了KAT2A是NCOA4依赖性巨噬细胞铁蛋白自噬的关键调节因子，其在缺血再灌注后促进肾损伤。重要的是，KAT2A的药理学抑制发挥了保护作用，突出了其治疗AKI的潜力。这项研究为AKI的发病机制提供了新的机制见解，并强调KAT2A作为未来治疗开发的一个有希望的靶点。
伦理批准和参与同意
经广东医科大学附属医院机构审查委员会和动物实验伦理委员会批准。本研究遵循《赫尔辛基宣言》。获得了所有参与者使用肾脏组织进行研究
