《Journal of Hepatocellular Carcinoma》：Prognostic Role of Mitotic Index in Hepatocellular Carcinoma: Potential Clinical Implications for Very Early Stage Disease
Abstract
背景
手术切除和消融治疗均是极早期肝细胞癌（HCC）的主要治疗选择。由于复发风险较高的患者可能从根治性切除术中比从消融术中获益更大，因此准确的风险分层至关重要。本研究探讨有丝分裂指数是否与HCC的早期复发相关，并可能作为优化极早期疾病风险评估的预后标志物。
方法
研究人员统计了来自三星医疗中心（SMC）的942例手术切除HCC代表性肿瘤切片中的有丝分裂数目。高有丝分裂指数定义为在10个高倍视野（HPF）中观察到超过8个有丝分裂。分析了有丝分裂指数与临床病理特征及预后的关系。并使用来自Hallym大学圣心医院（HUMC）的112例HCC病例进行了外部验证。
结果
296例患者被鉴定为高有丝分裂指数，其与侵袭性临床病理特征显著相关，包括更高的Edmondson分级、更晚的美国癌症联合委员会（AJCC）T分期以及早期肿瘤复发。高有丝分裂指数组患者的早期无复发生存期（e-RFS）显著缩短。在对极早期（BCLC 0期）患者的亚组分析中，高有丝分裂指数组同样显示出对e-RFS的不利影响。
结论
高有丝分裂指数是HCC患者早期复发的重要预测因子，并可能为极早期疾病提供有用的预后信息。虽然其在指导初始治疗选择方面的直接作用有限，但有丝分裂指数可有助于风险分层和术后管理策略的制定。
Introduction
肝细胞癌（HCC）是全球最常见的原发性肝癌，也是癌症相关死亡的第四大原因。手术切除是HCC的首选治疗方法，但肝切除术后患者预后不佳，主要原因在于高复发率。因此，利用适当的治疗策略准确预测肿瘤复发对于改善患者结局至关重要。
尽管已有多种预测HCC术后复发的生物标志物被研究，但大多数并未在日常病理检查中常规分析或使用。因此，迫切需要省时、易用且可重复的预测标志物来对可能经历术后早期肿瘤复发的HCC患者进行分层。
高细胞增殖是癌症的经典标志，肿瘤细胞的有丝分裂是显微镜下评估细胞增殖的一种简单有效的方法。有丝分裂指数的预后作用已在多种肿瘤类型中得到证实，目前已被用作包括乳腺、卵巢、肾上腺、皮肤、软组织和胃肠道在内的多种器官肿瘤分级系统的关键组织学因素。然而，有丝分裂指数在HCC中作为预测性生物标志物的预后作用尚未完全阐明。
对于极早期（BCLC 0期）HCC患者的治疗仍存在未满足的临床需求。虽然切除和消融治疗均被推荐，但两者之间的选择指南尚未明确建立。尽管许多研究报告在极早期HCC患者中两种治疗选项的预后无显著差异，但一些研究表明手术切除可能比消融提供更优的生存结果。因此，识别可靠的复发风险生物标志物有助于优化治疗选择。
本研究旨在更大的队列（n = 942）中进一步评估有丝分裂指数的预后效应，并在独立的外部队列（n = 112）中验证研究结果。特别关注有丝分裂指数是否与早期肿瘤复发（24个月内）相关，以及其是否可作为潜在的生物标志物为临床决策提供信息，尤其是在极早期HCC中。
Methods
患者选择
研究回顾性分析了2008年1月至2012年12月期间在三星医疗中心（SMC）接受肝切除术的1297例HCC患者。经过一系列排除标准（如术前接受其他治疗、围手术期死亡、切缘阳性、淋巴结或远处转移、门静脉侵犯、病理切片不可用等），最终942例适合病理切片复查的病例被纳入分析。图1展示了患者筛选流程图。外部验证队列包括2011年1月至2015年12月期间在Hallym大学圣心医院（HUMC）接受手术切除作为一线治疗的112例原发性HCC患者。
收集的临床信息包括年龄、性别、慢性肝病病因、血清甲胎蛋白（AFP）和白蛋白-胆红素（ALBI）评分。病理特征通过复查病理报告获得，包括肿瘤分化、微血管侵犯（MVI）、多中心发生、肝内转移、肿瘤坏死以及背景非肿瘤肝病理。HCC的组织学分化采用Edmondson-Steiner分级系统判定。多中心发生和肝内转移根据日本肝癌研究组的标准确定。以两年为界将肿瘤复发分为早期或晚期。患者根据美国癌症联合委员会（AJCC）第8版分期手册和BCLC分期系统进行分期。
术后，所有患者每3个月接受动态增强CT和血清AFP测量进行监测。当怀疑肿瘤复发时，额外进行动态增强MRI检查。肿瘤复发基于CT和/或MRI的影像学评估结果诊断。
主要终点是手术切除后24个月内的早期肿瘤复发，这主要与肝内转移相关，反映了肿瘤的侵袭性。本研究获得了相关机构的伦理委员会批准。
有丝分裂指数的评估
肿瘤细胞的有丝分裂指数评估如先前所述。由两位病理学家（SC和SP）检查苏木精-伊红（H&E）染色切片，计数10个高倍视野（HPF）中的有丝分裂数目。首先识别包含最多有丝分裂图形的热点区域。在热点区域计数后，将计数扩展到九个相邻的非重叠视野。若有丝分裂稀疏且随机分布在整个肿瘤中，无明确热点，则选择一个代表性视野开始计数。有丝分裂图形的评估基于Baak的标准，并且仅在两位病理学家使用多头显微镜达成共识时才被计入。有丝分裂指数取所评估视野中的最高有丝分裂计数。外部验证队列由一位病理学家（YAC）以相同方式确定有丝分裂指数。
统计分析
使用X-Tile统计软件包确定与患者生存相关性具有最佳统计学意义的高有丝分裂指数最佳截断值。根据确定的截断值将病例分为低和高有丝分裂指数组。采用卡方检验或Fisher精确分析有丝分裂指数与临床病理参数之间的关系。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。采用Cox回归分析评估与早期肿瘤复发独立相关的因素。使用R软件进行统计分析和可视化，以p值<0.05（双侧）为具有统计学显著性。
Results
患者特征
942例SMC患者的临床病理特征总结于表1。中位年龄为56岁（范围20-83岁）；男性761例（80.8%），女性181例（19.2%）。中位肿瘤大小为3.1厘米，195例（20.7%）患者肿瘤大于5厘米。759例（80.6%）患者感染乙型肝炎病毒（HBV），43例（4.6%）感染丙型肝炎病毒（HCV）。4例（0.4%）患者同时感染HBV和HCV。136例（14.4%）患者未检测到病毒标志物。约54%的患者为AJCC 1期疾病。最常见的BCLC分期为B期（480/942, 51.0%），其次是A期（263/942, 27.9%）和0期（199/942, 21.1%）。微血管侵犯（MVI）、肝内转移和多中心发生的发生率分别为45.2%、8.0%和6.1%。359例（38.1%）患者观察到肿瘤坏死。约44%的HCC发生在肝硬化的背景肝上。376例（39.9%）患者出现肿瘤复发，其中早期复发259例（27.5%），晚期复发117例（12.4%）。
HCC中的有丝分裂指数及其与临床病理特征的关联
942例HCC的总体有丝分裂指数分布如图2所示。平均有丝分裂指数为7.0（中位数3.5；范围0-132）。通过X-tile软件确定，在10个HPF中识别出8个或更多有丝分裂被定义为高有丝分裂指数，该值与早期无复发生存期（e-RFS）的相关性最佳。296例（31.4%）患者观察到高有丝分裂指数。高和低有丝分裂指数与临床病理特征的关联总结于表1。高有丝分裂指数与较年轻年龄（p = 0.001）、较高Edmondson分级（p < 0.001）、微血管侵犯（p < 0.001）、肿瘤坏死（p < 0.001）、更晚的AJCC T分期（p < 0.001）、AFP水平升高（p < 0.001）、乙型肝炎病毒感染（p < 0.001）以及早期肿瘤复发（p < 0.001）显著相关。
极早期（BCLC 0期）患者占21.1%（199/942）。有丝分裂指数与临床病理参数的相关性见表2。高有丝分裂指数组与较高的Edmondson分级（p = 0.010）、微血管侵犯（p = 0.029）、肿瘤坏死（p = 0.012）和早期肿瘤复发（p = 0.006）相关。
有丝分裂指数对HCC早期复发的影响
高有丝分裂指数组患者的e-RFS显著更差（2年复发率37.5% vs 24.3%；p < 0.001）（图3A）。在极早期（图3B）和早期（BCLC A期）肿瘤的特定亚组中，e-RFS的差异也具有统计学显著性（图3C和D）。
对所有患者进行的单变量分析显示，HCC早期复发与男性（p = 0.038）、较大肿瘤尺寸（p < 0.001）、较高Edmondson分级（p < 0.001）、微血管侵犯（p < 0.001）、肝内转移（p < 0.001）、多中心发生（p = 0.005）、更晚的AJCC T分期（p < 0.001）、更高的BCLC分期（p < 0.001）以及高有丝分裂指数（p < 0.001）显著相关。多变量分析显示，较大肿瘤尺寸（p = 0.016）、微血管侵犯（p < 0.001）、肝内转移（p < 0.001）、多中心发生（p = 0.002）和高有丝分裂指数（p = 0.009）是早期复发的独立预测因子（表3）。该多变量模型的区分度C-index为0.714（标准误SE, 0.016）。
在对极早期患者的亚组分析中，单变量分析显示微血管侵犯（p < 0.001）和高有丝分裂指数（p = 0.002）与早期复发显著相关（表4）。在极早期患者的多变量分析中，微血管侵犯（p = 0.007）和高有丝分裂指数（p = 0.013）是早期复发的独立预测因子。相应模型的C-index为0.707（SE, 0.044），表明具有适度的区分性能。
在主要SMC队列中，24个月时的时间依赖性受试者工作特征（ROC）分析显示，有丝分裂指数≥8对早期复发具有适度的预测能力。所有HCC患者的曲线下面积（AUC）为0.571，极早期HCC患者为0.636。
在独立HUMC队列中外部验证有丝分裂指数
112例HUMC患者的中位年龄为59岁（范围30-95岁）；男性96例（85.7%），女性16例（14.3%）。中位肿瘤大小为3.0厘米，26例（23.2%）患者肿瘤大于5厘米。73例（65.2%）患者感染HBV，7例（6.3%）感染HCV。1例（0.9%）患者同时感染HBV和HCV。31例患者未检测到病毒标志物。60例（53.6%）患者为AJCC 1期疾病。最常见的BCLC分期为A期（97/112, 86.6%），其次是B期（10/112, 8.9%）、0期（4/112, 3.6%）和D期（1/112, 0.9%）。微血管侵犯、肝内转移和多中心发生的发生率分别为34.8%、5.4%和9.8%。64例（57.1%）患者有背景肝硬化。早期和晚期肿瘤复发分别发生在29例（25.9%）和22例（19.6%）患者中。
HUMC队列中27例（24.1%）患者观察到高有丝分裂指数，其与较高Edmondson分级（p = 0.010）、肿瘤坏死（p = 0.021）、更晚的AJCC T分期（p = 0.010）、AFP水平升高（p = 0.014）以及早期肿瘤复发（p = 0.005）显著相关。极早期和早期（BCLC 0期和A期）患者分别占3.6%（4/112）和86.6%（97/112）。在极早期或早期HCC患者的亚组分析中，高有丝分裂指数组与较高的Edmondson分级（p = 0.007）、肿瘤坏死（p = 0.042）和AFP水平升高（p = 0.017）显著相关。
与SMC队列相似，高有丝分裂指数组的e-RFS显著更差（2年复发率50.6% vs 20.3%；p < 0.001）（图4A）。当分析极早期和早期患者时，也观察到统计学显著性（图4B和C）。
单变量分析显示，早期肿瘤复发与较大肿瘤尺寸（p = 0.013）、更晚的AJCC T分期（p = 0.036）和高有丝分裂指数（p = 0.001）显著相关。在多变量分析中，只有高有丝分裂指数（p = 0.011）是早期复发的独立预测因子。在对HUMC极早期或早期患者的单变量和多变量分析中，只有高有丝分裂指数显示出显著关联（p = 0.017）并且是早期肿瘤复发的独立预测因子（p = 0.029）。这些多变量模型的区分度C-index对于所有HCC患者为0.744（SE, 0.050），对于BCLC 0/A亚组为0.730（SE, 0.049），与主要队列中观察到的值相当。
在外部验证HUMC队列中，24个月时的时间依赖性ROC分析证明有丝分裂指数≥8对预测早期复发具有适度的区分能力。所有HCC患者的AUC为0.655，BCLC 0/A亚组为0.625。
Discussion
本研究评估了来自两个独立机构、接受手术切除作为主要治疗的大队列HCC患者中有丝分裂指数的预后意义。我们确定了与早期无复发生存期（e-RFS）最显著相关的高有丝分裂指数最佳截断值。特别评估了高有丝分裂指数是否能准确预测极早期HCC患者术后的早期肿瘤复发。
既往多项研究探讨了HCC中有丝分裂指数与临床病理因素的关系。本研究首次证明高有丝分裂指数是早期复发的独立预测因子，尤其是在极早期疾病中。
根据当前HCC治疗策略，切除或消融治疗被推荐为极早期HCC的主要治疗选择。但由于研究数据存在冲突，两者之间的选择尚无标准化标准。结合既往结果，可以估计手术切除组在无复发生存期（RFS）方面预后优于或至少类似于射频消融（RFA）。因此，对于具有高复发风险的HCC，应考虑将手术切除作为首选治疗方案以获得更好的RFS。
由于治疗前并未常规进行病理检查，既往研究均未将组织学发现作为独立变量进行评估，这可能是导致研究结果冲突的原因之一。肿瘤分化、Edmondson分级、微血管侵犯、坏死和有丝分裂指数均可作为预测RFS的变量，可能为RFA或手术切除后的复发提供个体化风险分层。
本研究证明，高有丝分裂指数是大队列HCC患者早期复发的独立预测因子，并在来自其他机构的独立外部队列中得到验证。更重要的是，对极早期HCC患者的亚组分析显示，高有丝分裂指数与不利的早期复发相关。有丝分裂指数的区分性能在两个队列中均可重复，时间依赖性AUC值在0.57至0.66之间，C-index约为0.71–0.74。尽管这些值表明预测能力仅为中等，但加强了研究结果的稳健性，并提示当与其他病理或影像学因素结合使用时，有丝分裂指数可能提供具有临床意义的信息。这些发现支持有丝分裂指数在早期复发风险评估中的作用，并表明其在极早期HCC的治疗决策或术后监测中具有潜在价值。
然而，我们也承认有丝分裂指数的直接临床适用性有限，因为它最常见于切除标本中评估，且在治疗前并非常规可用。尽管如此，有丝分裂图形也可以在肝活检样本中进行评估，这表明有丝分裂指数并非完全局限于术后评估。虽然肝活检并非在所有极早期HCC患者中进行，但对选定病例进行术前评估可能提供额外的预后信息。此外，由于有丝分裂计数是一种简单、廉价且广泛可用的组织学方法，有丝分裂指数可能有助于组织学分期系统和术后监测策略的制定。
虽然有丝分裂指数的直接组织学评估在术前并非常规可用，但非侵入性影像学方法可能提供补充信息。特别是18F-氟代脱氧葡萄糖（FDG）在正电子发射断层扫描（PET）/CT上的摄取已作为HCC的预后标志物被广泛研究，多项报告显示较高的FDG摄取与不利的肿瘤生物学特性和较差的术后结局相关。此外，FDG摄取与HCC中Ki-67表达呈正相关，而有丝分裂指数与Ki-67显示出强相关性。这些发现共同表明FDG摄取可能间接反映有丝分裂活性，从而作为肿瘤增殖潜能的替代标志物。虽然FDG PET/CT并未普遍应用于所有极早期HCC患者，但其与有丝分裂指数等组织学因素的整合可以增强风险分层，并为选定病例的监测或辅助策略提供额外指导。虽然需要进一步验证，但组织学和代谢影像标志物的融合代表了改善HCC个体化预后评估的一个有前景的方向。
本研究存在若干局限性。首先，其回顾性设计可能存在固有的选择偏倚，且两个队列均来自单一国家的机构，可能限制研究结果对其他人群的普适性。其次，虽然有丝分裂图形由两位病理学家共识评估，但不能排除一定程度的观察者间变异性，且本研究使用的截断值尚未经过普遍验证。第三，虽然尝试了外部验证，但外部队列相对较小的样本量降低了统计效力，特别是在亚组分析中。最后，有丝分裂指数的临床适用性仍然有限，因为它通常在手术标本中评估，术前并非常规可用；未来需要结合活检评估或与非侵入性影像标志物整合的研究来确立其在指导治疗决策中的作用。
Conclusion
总之，本研究证明HCC的高有丝分裂指数与侵袭性临床病理参数相关，包括更高的早期复发风险，尤其是在极早期疾病中。有丝分裂指数可作为一个有用的预测和预后生物标志物，有助于临床实践中的风险分层。虽然其在主要治疗决策中的直接作用有限，但可以为极早期HCC患者的个体化管理策略和术后监测提供额外信息。
Ethics Statement
所有涉及人类参与者的研究程序均符合机构和国家研究委员会的伦理标准以及1964年赫尔辛基宣言及其后续修正案或可比伦理标准。本研究获得了相关机构伦理委员会的批准。由于这是一项使用去标识化医疗记录的回
