蛋白酶K高效复苏霍乱弧菌存活非可培养状态的创新策略及其环境监测应用

《Applied and Environmental Microbiology》：Efficient resuscitation of early-stage viable but non-culturable cells of Vibrio cholerae using treatment with proteolytic enzymes

本研究揭示了蛋白酶K等蛋白水解酶能有效复苏低温诱导的霍乱弧菌（Vibrio cholerae）存活非可培养（VBNC）状态细胞，并开发了MPN–qPCR（最可能数-定量聚合酶链反应）联合酶处理的新检测方法，为环境水体及食品中潜在致病菌的风险评估提供了关键技术突破。

　　

ABSTRACT

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）作为霍乱的病原体，广泛存在于环境半咸水中。暴露于低温会诱导其进入存活但非可培养（VBNC）状态。本研究通过逐步降温至4°C的方式，发现相较于急剧降温，能延迟细菌向非可培养状态的转变，表明霍乱弧菌细胞对低温具有部分适应性。维持在4°C的VBNC细胞逐渐丧失恢复可培养状态的能力，但处于休眠早期的VBNC细胞经蛋白酶K等蛋白水解酶处理后能高效复苏。利用最可能数（MPN）–定量聚合酶链反应（qPCR）法对半咸水 estuary 水样中可培养霍乱弧菌进行定量，结果显示，经蛋白酶K预孵育的水样中可培养细胞浓度分别为93和1,500 MPN/mL，而未经处理的样品中则未检测到。同样，酶处理后弧菌属（Vibrio）的丰度也显著增加。通过CHROMagar Vibrio平板计数法进一步验证，蛋白酶K处理使菌落形成数提高超过100倍。这些发现表明，蛋白酶K处理能有效复苏和定量环境水样中的霍乱弧菌VBNC细胞。

INTRODUCTION

弧菌属（Vibrio）细菌为革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，广泛分布于多种水生环境，其中部分种类是重要的人类病原体，可引起肠道及肠道外感染。霍乱弧菌通过污染鱼、贝类或饮用水引发严重水样腹泻。该菌根据O抗原差异分为200多种血清群，仅O1和O139血清群能引起流行性霍乱。在温带地区，弧菌的生长受水温显著影响，冬季水温低于10°C时通常无法检测，而夏季水温达20°C以上时则密度较高。当面临低温或营养匮乏等环境胁迫时，霍乱弧菌等多种食源性病原体会进入VBNC状态。VBNC细胞代谢活跃，维持高ATP水平、膜电位及分子伴侣蛋白表达，但仍无法在常规培养基上增殖。此类细胞在适宜条件下可复苏，潜在致病性不容忽视。近期研究表明，蛋白酶K能显著促进霍乱弧菌VBNC细胞的复苏，提示肠道中的蛋白水解酶可能触发VBNC细胞在宿主体内恢复活性。

MATERIALS AND METHODS

研究采用三株霍乱弧菌非O1/非O139菌株（BPS64、AN67、APS1），通过碱性蛋白胨水（APW）培养后，于人工海水（ASW）中调整细胞密度（10⁷、10⁵、10³CFU/mL），分别进行恒定4°C与逐步降温（20°C→15°C→10°C→4°C）处理，定期通过CHROMagar Vibrio平板计数可培养细胞。VBNC细胞经蛋白酶K、胰蛋白酶或 thermolysin（100 μg/mL）处理24小时后评估复苏效果，并利用亮抑蛋白酶肽（leupeptin）抑制胰蛋白酶活性验证酶活依赖性。通过MPN–qPCR法靶向霍乱弧菌特异基因ompW定量环境水样中的可培养细胞，同时以16S rRNA基因引物检测弧菌属总量。

RESULTS AND DISCUSSION

Effects of cell density and incubation temperature on the induction of the viable but non-culturable state

霍乱弧菌在4°C下约60天进入非可培养状态。初始细胞密度越低，失去可培养性的速度越快：菌株BPS64在10⁵CFU/mL时第10天、10³CFU/mL时第4天即无法形成菌落。逐步降温较恒定低温能延迟非可培养状态的出现，表明细菌对渐进式低温胁迫存在适应性，可能与冷休克蛋白（Csps）诱导有关。

Resuscitation of VBNC cells using treatment with proteolytic enzymes

VBNC细胞在进入非可培养状态后21天内，经蛋白酶K、胰蛋白酶或thermolysin处理均可显著复苏，菌落数超过初始密度。亮抑蛋白酶肽能抑制胰蛋白酶的复苏效果，且酶活测定显示其蛋白酶活性被抑制90%，证实蛋白水解活性与复苏能力直接相关。VBNC细胞随休眠时间延长逐步丧失复苏能力，分为三个阶段：无需酶处理即可复苏、需酶处理复苏、完全丧失复苏能力。

Estimation of V. cholerae culturable cells by the MPN–qPCR method

MPN–qPCR法与平板计数结果一致，验证了其定量可靠性。对VBNC状态的APS1菌株进行蛋白酶K处理，第6天和第19天均成功复苏，而第27天则无响应，进一步表明仅早期VBNC细胞对酶处理敏感。

Application of the improved MPN–qPCR method to estimate V. cholerae in environmental brackish water

对旭川河口半咸水样的检测显示，9月水样（水温27.5°C、24.7°C）经蛋白酶K处理后霍乱弧菌密度分别为1,500 MPN/mL和93 MPN/mL，未经处理则未检出。10月水样（19.0°C）即使酶处理也未检测，提示VBNC细胞可能进入深度休眠。弧菌属总量经酶处理后增幅达100倍以上，平板计数结果与MPN–qPCR高度一致，证实环境中绝大多数弧菌处于VBNC状态。

结论

本研究证实蛋白水解酶能高效复苏霍乱弧菌早期VBNC细胞，所建立的改进MPN–qPCR法为环境水体及食品中VBNC病原体的检测提供了灵敏、可靠的工具。鉴于鱼类、贝类及人类肠道中普遍存在蛋白水解酶，VBNC细胞在宿主体内复苏的风险需引起高度重视。该方法优化后有望应用于环境监测系统，提升公共卫生安全保障水平。