HDV RNA检测的精准之困：三种qRT-PCR试剂盒的定量偏倚与热休克前处理的影响评估

《Journal of Clinical Microbiology》：Challenges in accurate HDV RNA quantification: inter-assay variability and the impact of thermal shock

本研究通过头对头比较Vircell、Certest和Altona三种HDV RNA qRT-PCR检测试剂盒，揭示了其在定性诊断上高度一致（κ=0.988-1.000），但存在显著的定量偏倚（Vircell和Certest分别高估0.33和0.24 log10IU/mL）。同时，研究证实热休克（thermal shock）前处理虽能提升低病毒载量样本的检出率，但会显著增加定量变异性，导致检测间相关性下降（R2从0.720降至0.684），因此不推荐用于常规治疗监测。

研究背景与目的

丁型肝炎病毒（HDV）是一种独特的RNA病原体，其复制依赖于乙型肝炎表面抗原（HBsAg），可导致高度侵袭性的病毒性肝炎，迅速加速肝硬化和肝细胞癌的进展。尽管其临床严重性，HDV的全球负担仍知之甚少，全球流行率估计从1200万到超过7000万人不等。HDV具有显著的遗传多样性，分为8种基因型，其高度稳定的杆状二级RNA结构对分子诊断检测提出了重大挑战。随着Bulevirtide等新疗法的批准，HDV RNA的定量监测变得至关重要，其疗效通常定义为HDV RNA下降≥2 log₁₀IU/mL或达到不可检测水平。然而，检测缺乏标准化，导致显著的检测间变异性，即使是0.3至0.5 log₁₀IU/mL的系统性偏倚也可能导致对治疗反应的误解。此外，热休克（thermal shock）等前处理程序，即通过加热步骤破坏HDV RNA二级结构以提高扩增效率，其临床效用仍存在争议。因此，本研究旨在头对头比较三种研究用途（RUO）qRT-PCR检测试剂盒（Vircell、Certest、Altona）的性能，并系统评估热休克前处理对HDV RNA定量的影响。

材料与方法

本研究为一项横断面单中心研究，纳入了206名参与者的冷冻保存血清（n=150）或血浆（n=56）样本。样本分为两组：HDV阳性组（n=106，HBsAg阳性和抗HDV阳性）和对照组（n=100，HBsAg阴性或HBsAg阳性/抗HDV阴性）。所有实验室程序均在西班牙阿斯图里亚斯王子大学医院进行。使用MagCore HF16系统从400 μL样本中提取核酸，最终洗脱体积为40 μL。在CFX Opus 96实时PCR系统上，使用三种RUO检测试剂盒进行qRT-PCR：VIASURE HDV q Real-Time PCR Detection Kit（Certest）、Hepatitis Delta Real-time PCR kit（Vircell）和AltoStar HDV PCR Kit 1.5（Altona）。所有检测均采用经WHO国际标准校准的定量标准品。在标准工作流程的同时，对提取的RNA等分试样应用热休克程序（95°C孵育10分钟，然后立即在-20°C冷却至少10分钟）。通过常规PCR和Sanger测序对HDV RNA阳性样本进行基因分型。统计分析包括使用Cohen's kappa系数评估检测间一致性，使用Pearson相关系数（R2）分析定量相关性，并使用Bland-Altman图评估系统性偏倚。

结果

定性一致性结果

所有对照组样本（n=100）在三种qRT-PCR检测中均为阴性。在HDV阳性组的106份样本中，Altona检测检出56份（52.8%）HDV RNA阳性，而Vircell和Certest检测各检出55份（51.9%）阳性。唯一的差异出现在一个病毒载量极低的样本中（Altona定量为4.87 IU/mL）。Vircell检测报告该样本为阴性，而Certest检测的循环阈值（Ct）为40.37，略高于其阳性临界值（Ct ≤ 40.00）。在56份HDV RNA阳性样本中，成功对41份进行了基因分型，均鉴定为HDV基因型1。Vircell和Certest检测显示出完美的定性一致性（100%一致性，κ=1.000）。与Altona检测相比，Vircell和Certest均显示出近乎完美的一致性，总体一致性为99.5%，Kappa评分为0.988。

定量结果

对于定量分析，56份HDV RNA阳性样本中有51份获得了结果，其余5份样本低于所有检测的定量范围。Certest和Vircell检测之间的比较显示出最弱的相关性（R2=0.720）。相应的Bland-Altman分析显示，Vircell检测报告的病毒载量略高于Certest检测，平均偏倚为0.238 log₁₀IU/mL。相比之下，Certest和Altona检测之间的相关性最强（R2=0.864）。然而，Bland-Altman图显示Certest检测报告的病毒载量始终高于Altona检测，存在相关的系统性负偏倚（-0.239 log₁₀IU/mL）。同样，Vircell和Altona之间的比较显示出中等相关性（R2=0.793），并揭示了更大的系统性负偏倚（-0.334 log₁₀IU/mL），证实Vircell检测产生的病毒载量也高于Altona。

热休克结果

热休克前处理程序对所有56份HDV RNA阳性样本进行了评估。总体而言，该程序并未导致任一检测的中位Ct值或中位病毒载量发生统计学显著变化（所有P>0.65）。然而，检测内分析显示，该程序引入了相当大的定量变异性。尽管标准程序与热休克程序之间的相关性对于Certest（R2=0.826）和Vircell（R2=0.721）分别为强和中度，但Bland-Altman图显示了广泛的95%一致性界限，表明对单个样本的影响不一致。此外，该程序显著损害了两种检测之间的定量一致性。Certest和Vircell检测之间的相关系数（R2）从标准程序的0.720降至热休克后的0.684。热休克后的Bland-Altman分析证实了微不足道的平均偏倚（-0.0508 log₁₀IU/mL），但揭示了广泛的一致性界限，表明检测间定量一致性差。该程序成功地将唯一的不一致样本从阴性转化为阳性，并在相当一部分样本中诱导了显著的病毒载量增加（Certest为19.1%，Vircell为24.5%）。

讨论

本研究证实，虽然Vircell、Certest和Altona HDV RNA检测对于初步诊断是可靠的，但它们表现出相关的定量偏倚，阻碍了它们在治疗反应监测中的互换使用。我们的关键发现强调了检测间极好的定性一致性，但根据比较检测的不同，存在系统性高估病毒载量的情况。此外，我们证明，热休克前处理程序虽然可能增强低病毒血症病例的敏感性，但引入了不可接受的定量变异性，损害了其常规临床使用的效用。

Vircell、Certest和Altona检测的高度一致性对于诊断实验室来说是一个关键且有用的发现。Certest和Vircell检测之间显示出完美的一致性，与Altona检测也显示出近乎完美的一致性（κ=0.988）。观察到的唯一差异是一个病毒载量极低的样本，该样本低于Vircell和Certest的检测限。这突显了虽然这些检测对于诊断活动性感染高度可靠，但分析灵敏度的微小差异会影响检测阈值附近的结果。

虽然定性可靠，但我们的定量分析显示，与Altona检测相比，Certest和Vircell检测均系统性高估HDV RNA水平。我们确定了-0.239 log₁₀IU/mL（Altona–Certest）和-0.334 log₁₀IU/mL（Altona–Vircell）的相关负偏倚，表明Certest和Vircell报告的病毒载量分别高于Altona。这种情况可能是由于目标HDV基因组区域或引物组成的差异所致。这些差异可能具有直接的临床意义。对于接受Bulevirtide等治疗的患者，病毒学反应通常定义为病毒载量下降≥2 log₁₀IU/mL，超过0.3 log₁₀IU/mL的系统性偏倚可能不仅仅是统计上的细微差别，而是数量上的显著差异。它可能导致患者对治疗反应的错误分类。因此，我们的结果强烈支持建议，必须使用相同的检测来对患者的HDV RNA进行序贯监测，以减轻这种关键的检测间变异性。

我们研究的一个新颖方面是对热休克前处理的系统评估。该程序与HDV RNA说明书中的建议不一致。然而，为了提高qRT-PCR效率，一些作者推测预处理RNA洗脱液是一个关键步骤。由于HDV基因组的高GC含量（约70%），其形成复杂的二级结构，可能阻碍引物与目标区域的结合。其基本原理是热休克使这种结构变性，从而改善定量。与这一假设一致，我们观察到它成功地将唯一的不一致样本从阴性转化为阳性，并在相当一部分样本中诱导了临床相关的病毒载量增加（Certest为19.1%，Vircell为24.5%）。然而，这种潜在的好处被定量变异性的显著增加和检测间一致性的下降所抵消。关键的是，应用热休克后，Certest和Vircell之间的相关性恶化（R2从0.720降至0.683）。这表明该程序的效果不是均匀的，并且可能放大检测之间的现有差异。因此，我们的数据表明，任何潜在的敏感性益处都被定量精度的关键损失和根据所用检测的不同性能所抵消，因此不建议将其常规用于治疗监测。

结论

总之，我们的头对头比较表明，Vircell、Certest和Altona检测在HDV定性诊断方面表现出高度可靠性，这通过极好的一致性得到证明。相反，相关定量偏倚的存在阻碍了它们在治疗监测中互换使用的适用性。为了确保病毒载量趋势的准确解释，临床医生必须在纵向患者监测中采用相同的检测。此外，热休克前处理程序存在显著局限性，因为其在某些情况下增强检测的能力被不可接受的定量变异性程度所抵消。因此，不建议将其常规应用于患者监测。