《Journal of Virology》：Mutational analysis of human norovirus VP2 elucidates critical molecular interactions for virus assembly
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本综述系统阐述了人诺如病毒（HuNoV）次要衣壳蛋白VP2在病毒颗粒组装中的核心作用。研究通过生物信息学分析和突变实验，首次鉴定出GII.4基因型HuNoV VP2蛋白N端α螺旋结构域中一个由40-43位氨基酸（KLQQ）构成的VP1相互作用基序（VIM），并证实VP2通过其C端内在无序区域（IDR）与病毒基因组连接蛋白（VPg）相互作用，从而充当连接主要衣壳蛋白（VP1）与内部组分（VPg）的“分子桥梁”（molecular bridge），为理解HuNoV衣壳组装机制及开发靶向疗法提供了新视角。
人诺如病毒（HuNoV）是引起全球范围内病毒性肠胃炎的主要病原体，其中GII基因群，特别是GII.4基因型，导致了超过80%的感染病例。HuNoV是一种无包膜病毒，其二十面体衣壳由90个主要衣壳蛋白（VP1）二聚体构成，内部包裹着次要结构蛋白VP2以及通过VPg连接的正义单链RNA（ssRNA）基因组。尽管通过晶体学和冷冻电镜（cryo-EM）对由VP1自组装形成的病毒样颗粒（VLP）的原子结构已有深入表征，但VP2和VPg在衣壳内部的具体结构、定位、它们被纳入衣壳的机制以及三者之间是否存在相互作用等问题仍未解决。本研究旨在阐明VP2是包含VP1、VP2和VPg的病毒颗粒组装过程中的关键分子桥梁。
VP2由保守的α螺旋结构域和内在无序结构域组成
对代表不同HuNoV基因群的VP2蛋白序列进行多重序列比对（MSA）发现，VP2的长度和序列在不同基因型间存在显著差异。例如，GI.1型HuNoV的VP2长度为212个氨基酸（AA），而GII.3和GII.4型的VP2分别长达254和268个氨基酸。GII.4型VP2长度的增加部分归因于其第43位氨基酸处有一个独特的插入片段（AA 43-53）以及近C端的几个较小插入。序列保守性分析显示，VP2的N端区域（AA 1-134）和C端区域（AA 211-291）含有较高密度的保守残基，而中心区域（AA 135-210）则高度分化。
利用AlphaFold 3进行结构预测表明，HuNoV VP2包含一个N端的高置信度α螺旋结构域（约AA 1-105）和一个大部分呈内在无序（intrinsically disordered）的C端区域（约AA 123-268）。对GII.4悉尼株VP2的预测显示，其N端α螺旋区域具有很高的预测局部距离差异测试（plDDT）分值（>90），而C端结构域的plDDT分值很低（<50）。这种plDDT分值的急剧下降与通过IUPRED3预测的无序性相吻合，支持VP2的C端大部分是内在无序区域（IDR）的结论。保守模式与结构预测结果一致，表明α螺旋结构域受到了进化上的约束。尽管不同基因群间序列差异很大，但AlphaFold 3预测所有代表基因群的VP2二级结构基本保守，均编码一个N端α螺旋和一个可变的C端无序区域。
值得注意的是，在引起全球流行的GII.4病毒中，VP2的第37至43位氨基酸区域与其他HuNoV相比具有独特性。对包含1,373个GII病毒VP2序列的NCBI BLASTp数据库簇的分析进一步证实，该区域（特别是AA 39-43）含有连续的高度保守残基，其中AA 41-43和109-111在几乎所有序列中完全保守。因此，研究将目光聚焦于VP2的N端区域（直至AA 50），以探寻其与VP1可能的相互作用位点。
VP2高度保守的N端包含一个推定的VP1相互作用基序
为了确定VP2上与VP1相互作用的关键区域，研究在HEK293FT细胞中共表达了带有3xFLAG标签的野生型或突变型VP2与野生型VP1，并通过共免疫沉淀（co-IP）和蛋白质印迹（Western blot）进行分析。首先，实验测试了VP1与全长VP2（AA 1-268）或截短VP2（AA 28-268 或 AA 50-268）的相互作用。结果显示，VP1能与全长VP2以及VP2 28-268相互作用，但不能与VP2 50-268相互作用，这表明VP2的第28至50位氨基酸对于其与VP1的结合至关重要。
为了进一步解析VP2 N端高度保守残基在VP1相互作用中的作用，研究在VP2的高度保守残基39-42（RKLQ）和40-43（KLQQ）处引入了特定的谷氨酸（E） substitutions。为了排除融合标签位置对蛋白质折叠和生化特性的潜在影响，实验还测试了3xFLAG标签位于VP2 N端或C端的构建体。co-IP实验表明，将VP2的40KLQQ43突变为4×谷氨酸（EEEE）会完全破坏VP1与VP2的相互作用，而将39RKLQ42突变为EEEE则不影响相互作用，且3xFLAG标签的位置不影响这一结果。这表明GII.4 HuNoV VP2的第40-43位氨基酸（KLQQ）是与其主要衣壳蛋白VP1相互作用的关键。
VP2第40-43位氨基酸的完全突变是破坏其与VP1相互作用所必需的
接下来，研究分析了VP2 N端结构域内的整个KLQQ基序（AA 40-43）是否都是与VP1相互作用所必需的。AlphaFold结构建模预测VP2的第42位谷氨酰胺（Q42）和Q43朝向VP1的壳区（S domain），可能参与与VP1的氢键形成。值得注意的是，Q42在所有代表HuNoV的VP2中都是保守的，而Q43则是GII.4病毒特异性插入序列的第一个氨基酸。
研究首先将40KLQQ43突变为带负电荷的40EEEE43。为了检验相互作用的丧失是否源于净负电荷的引入，研究还构建了中性电荷的4×丙氨酸（AAAA） substitutions。co-IP实验显示，无论是突变为4×E还是4×A，都会破坏VP1与VP2的相互作用，这表明相互作用的丧失并非电荷替换的人为假象。此外，仅将第42-43位的QQ突变为2×E或2×A，VP2仍能保持与VP1的相互作用，说明单独突变这两个残基不足以破坏相互作用。
进一步的突变扫描显示，单个残基的突变（如Q31E, K40E, L41E）、连续两个残基的突变（K40E+L41E）甚至三个残基的突变（K40E+L41E+Q42E）均不能破坏VP2-VP1相互作用。只有同时突变全部四个残基（AA 40-43）才会导致相互作用丧失。研究还评估了先前通过酵母双杂交系统筛选提出的位于VP2 C端（AA 174-179）的另一个可能的VP1相互作用位点。然而，将GII.4 VP2的174TSTRLG179突变为6×E后，VP2仍能与VP1相互作用，表明该C端区域并非GII.4 VP1相互作用的关键位点。
通过靶向VP2（而非VP1）的非变性条件下的反向免疫沉淀实验发现，当使用VP1抗体进行沉淀时，可以共沉淀到3xFLAG-VP2和VP2-3xFLAG；但当使用FLAG抗体沉淀VP2时，却无法共沉淀到VP1-VP2复合物。这表明存在一部分被内化到VLPs内部的VP2（无法被抗体接近）和另一部分存在于细胞质中、可被抗体接近的游离VP2。这些发现共同揭示，GII.4悉尼株VP2高度保守的α螺旋结构域上，由40-43位氨基酸构成的、包含静电、极性和疏水相互作用的复合表面，是其与VP1相互作用的关键。
HuNoV VP2是促进病毒颗粒组装的分子桥梁
考虑到VP1、VP2和VPg共同构成HuNoV衣壳，研究接下来探究了这三者如何形成异源多聚体复合物。研究人员推测，VP2预测的内在无序区域（IDR）可能与同样具有IDR的VPg发生相互作用。co-IP实验证实，无论HA标签位于VPg的N端还是C端，3xFLAG-VP2都能与HA-VPg相互作用。即使VP2的40EEEE43突变体也能与VPg相互作用，表明VP2的40-43位氨基酸并非VPg结合所必需。反向IP靶向VPg也能沉淀出3xFLAG-VP2，进一步确认了VP2与VPg的相互作用。相比之下，VP1与HA-VPg或VPg-HA共表达后，无论使用VP1抗体还是HA抗体进行沉淀，均未检测到VP1与VPg的直接相互作用。
为了确定VP2上与VPg相互作用的区域，研究测试了VP2的截短体。结果显示，仅包含预测的N端α螺旋结构域（AA 1-105）的VP2不能沉淀VPg，而包含预测的C端IDR（AA 106-268）的VP2截短体则足以与VPg相互作用。这些结果表明，VP1只与VP2相互作用，而VP2则能与VP1和VPg两者相互作用，从而在衣壳组装中扮演中心角色。
最后，研究检验了VP2是否能同时与VP1和VPg结合形成三元复合物。当VP1和VPg在没有VP2的情况下共表达时，VP1无法沉淀VPg。然而，当共表达VP1、VPg和带有完整VIM（AA 40-43 KLQQ）的VP2-3xFLAG时，VP1能够沉淀出与VPg相互作用的VP2，形成VP1-VP2-VPg复合物。重要的是，当表达VIM突变体（40AAAA43或40EEEE43）时，形成的颗粒仅包含VP1，表明VP2是招募VPg进入组装复合物所必需的。这些结果阐明了HuNoV病毒颗粒组装中衣壳蛋白间的相互作用网络，其中VP2作为分子桥梁，独特地连接着外部衣壳VP1和内部组分VPg。
讨论
本研究通过计算分析指导生化实验，深入探讨了HuNoV内部衣壳蛋白的相互作用以及VP2在组装中的作用。研究发现GII.4 HuNoV编码最长的VP2蛋白，这可能与其引起全球六次大流行的适应性有关。研究鉴定出的位于VP2 N端α螺旋结构域上的VIM（AA 40-43 KLQQ）对GII.4 HuNoV与VP1的相互作用至关重要，且需要全部四个残基参与，提示这是一个由互补电荷和疏水相互作用构成的复合相互作用表面。
本研究存在一些局限性，例如涉及HEK细胞中病毒蛋白的过表达，且co-IP研究无法区分游离的细胞质蛋白和VLP相关的蛋白，也无法确定蛋白质相互作用是直接还是间接的。HEK细胞缺乏HuNoV的进入受体，并非完全允许性细胞系。未来通过单颗粒重构解析纯化的VP1+VP2 VLPs的原子结构，将有助于进一步澄清这些问题。
近期研究表明，VP2对于猫杯状病毒（FCV）和鼠诺如病毒（MNV）产生感染性颗粒是必需的。FCV的VP2参与病毒生命周期的早期事件，可能通过形成孔洞结构协助病毒基因组进入细胞质。本研究发现VP2（而非VP1）能够特异性地与VPg结合，且其C端IDR足以介导这一相互作用，这支持了VP2在病毒复制周期两端（即在感染开始时解包基因组，在颗粒组装时帮助招募VPg）均发挥作用的可能性。VP2和VPg中存在的扩展IDR是病毒蛋白进行动态多价相互作用的特征，并被病毒用于诱导液-液相分离（LLPS），HuNoV很可能利用这一机制形成复制中心。综上所述，本研究揭示了VP2在HuNoV颗粒组装中的核心作用，提出了一个新的范式，即VP2通过连接外部VP1衣壳和内部VPg有效载荷，来协调衣壳的形态发生。这些发现增进了对HuNoV衣壳组装机制的理解，并为开发靶向病毒组装过程的抗病毒策略提供了新的潜在靶点。
