《Acta Biomaterialia》：Characterization of the Egg Glue Protein from Two Belostomatidae Family Aquatic Water Bugs,
Appasus japonicus and
Lethocerus indicus
编辑推荐：
研究鉴定了两种水生昆虫（A. japonicus和L. indicus）的蛋胶蛋白并分析其特性，发现两者蛋胶蛋白序列相似度达62%，均依赖半胱氨酸二硫键形成粘附力，且A. japonicus的蛋白水抗性更强。通过质谱分析和光谱学研究揭示了蛋白固化过程中β-折叠结构的形成机制，为理解昆虫繁殖适应进化提供了新证据。
权娜英|罗秀和|尹朱英|赵秀芝|朴彩元|李世赫|金朱贤|朴尚允
韩国首尔松实大学系统生物医学科学学院与基础科学综合研究所，邮编06978
摘要
卵胶蛋白对水生昆虫的生存至关重要，因为它们能够将卵牢固地附着在基质上，防止卵被水冲走。在这项研究中，我们旨在鉴定并表征两种属于Belostomatidae科的水生昆虫——Appasus japonicus和Lethocerus indicus的卵胶蛋白。这两种昆虫都被称为“趾咬虫”或“巨型水虫”。这两种昆虫在各自的栖息地中采用了独特的黏附策略来保护它们的卵：A. japonicus将卵产在雄性昆虫的背部，通常位于水下；而L. indicus则将卵产在水面以上的植被上。通过质谱分析和氨基酸分析等蛋白质组学方法，我们鉴定出了A. japonicus卵块中的富含半胱氨酸的卵胶蛋白。利用这一序列，在L. indicus的基因组中找到了相应的同源蛋白，并通过重组技术生产出了这两种蛋白以进行进一步研究。正如预期的那样，A. japonicus的卵胶蛋白具有更强的耐水性，在干燥和湿润条件下都具有相似的黏附强度。此外，圆二色光谱实验和红外光谱分析表明，在固化过程中发生了结构变化，使得固体形式的卵胶蛋白中β-折叠结构含量增加。
意义声明
水生昆虫将其卵牢固地附着在靠近水面的环境中，但它们所使用的卵胶蛋白在分子水平上的研究仍然非常有限。本研究鉴定了两种具有不同产卵策略的“巨型水虫”——Appasus japonicus（将卵产在雄性昆虫背部）和Lethocerus indicus（将卵产在植物茎秆上）的卵胶蛋白。我们发现，这两种昆虫的卵胶蛋白都富含半胱氨酸，大小约为13 kDa，其氨基酸序列有约62%的相似性。我们还发现，它们的黏附性依赖于半胱氨酸残基之间的二硫键。这项研究扩展了我们对昆虫繁殖策略的理解，并展示了另一种基于蛋白质的耐水黏附机制，这可能有助于开发生物粘合剂。
引言
在大多数昆虫的产卵过程中，雌性昆虫会分泌一种黏性物质与卵一起释放，以确保卵能够牢固地附着在适宜的环境中。这些所谓的“卵胶”是基于蛋白质的分泌物。昆虫的进化成功部分依赖于这些卵胶蛋白，因为卵在其生命周期中最容易受到威胁。已经使用生化和机械方法研究了多种昆虫的卵胶蛋白[1]。然而，这些基因及其对应蛋白质序列的精确鉴定和表征直到最近才得到详细研究。到目前为止，只有少数昆虫物种的卵胶蛋白得到了鉴定和表征，例如人类头虱（Pediculus humanus capitis/corporis）、蚕（Bombyx mandarina）和普通床虱（Cimex lectularius）[[2], [3], [4]]。虽然螳螂的卵鞘通常不被归类为卵胶，但其特定的蛋白质结构也已得到研究[5]。这些研究表明，这些卵胶蛋白的序列具有独特性和多样性，表明每种昆虫群体的卵胶蛋白可能是独立进化的结果。在这项研究中，我们试图鉴定属于Belostomatidae科的水生半翅目昆虫的卵胶蛋白。
Appasus japonicus属于Belostomatidae科，分布于亚洲和非洲的静水栖息地，体长约2厘米。作为该科的所有成员，它们利用口器注入含有酶和毒液的唾液，从而吸取猎物（如小鱼或蝌蚪）的半消化液体。A. japonicus的显著特征是雌性将卵产在雄性昆虫的背部，雄性会照料卵直到它们孵化[6]。与之相关的A. major和Diplonychus esakii物种的雌性也将卵产在雄性背部，这些物种分布于韩国、日本和中国东部。在这些物种中，雄性通过频繁进入水中来保持雄性背部卵的湿润。
Belostomatidae科还包括其他几个属。例如，Lethocerus属的昆虫体型较大（5~9厘米），分布于亚洲、美洲、欧洲、非洲和澳大利亚等地[7]。其中著名的物种L. indicus原产于南亚、东南亚和新几内亚，可作为可食用昆虫用于多种东南亚菜肴。另一种体型较大的巨型水虫Kirkaldyia deyrollei（以前归类于Lethocerus属）分布于日本、韩国和中国东部。K. deyrollei的眼睛间距较宽，前股节内侧有两条不对称的沟槽，这有助于将其与Lethocerus属区分开来[8]。另一个单型属Benacus的代表物种B. griseus仅分布于北美洲。有趣的是，这些属的昆虫都将卵产在水面以上的植被茎秆上，与A. japonicus不同。然而，这些物种的雄性也会通过保护和保持卵的湿润来提供亲代抚育[9,10]。雄性会定期湿润身体并将水滴在卵上以防止干燥。K. deyrollei在韩国农村地区较为常见，但由于其对光线的吸引力而濒临灭绝，因此被韩国环境部列为濒危物种[11]。这些物种都捕食猎物，并利用口器注入唾液来吸收猎物的体液。研究表明，唾液中含有多种能够麻痹猎物并分解蛋白质的毒液和酶[12,13]。
如前所述，尽管A. japonicus体型较小，L. indicus体型较大，但它们属于同一科。这两种昆虫的产卵环境存在显著差异：A. japonicus的卵产在雄性背部，并通过浸入水中保持湿润；而L. indicus的卵则产在相对干燥的位置，完全与水分离。这两种昆虫卵胶蛋白的差异会对它们的分子进化产生选择压力，不仅影响耐水性，还涉及其他环境因素。例如，由于A. japonicus的卵暴露在水中，其卵胶蛋白会受到更多盐分的离子干扰，从而减弱黏附性能；而持续的水分接触还可能导致微生物滋生，而空气中的卵则较少受到生物降解压力的影响。由于这些不同的产卵行为，卵胶蛋白的组成和功能可能经历了不同的进化适应。因此，鉴定并比较这两种昆虫的卵胶蛋白序列不仅有助于了解另一种基于蛋白质的黏附机制，还能揭示它们在相同科内不同产卵行为下的进化适应。本文报告了A. japonicus和L. indicus>这两种Belostomatidae科昆虫的卵胶蛋白，并进一步分析了通过E. coli表达系统重组获得的两种同源蛋白的黏附和结构特性。
实验部分
A. japonicus的饲养及卵胶从卵壳中的分离
我们从当地昆虫宠物店购买了一组雌雄A. japonicus，并将它们饲养在40厘米×25厘米×25厘米的水族箱中，喂食孔雀鱼（Poecilia reticulata）（图S1A）。当观察到雄性背部有卵块时，卵通常在两周内孵化（图1）。漂浮在水面上的卵壳团块上覆盖着卵胶。我们在立体显微镜下手动将卵胶从卵壳中分离出来（图1和图
利用质谱（MS）进行蛋白质组学分析以寻找卵胶
在最后一个若虫孵化后，附着在A. japonicus雄性背部的卵块漂浮在水面上（图S1A）。我们将空卵壳和卵胶手动分离出来，并在多种已知能溶解蛋白质的条件下进行处理。卵胶在约3% SDS和约600 mM DTT溶液（改良SDS样品缓冲液）中溶解，而卵壳在最高浓度的尿素或胍溶液中保持不溶解
结论
多年来，人们一直在研究昆虫卵胶，但直到最近才通过多种昆虫物种的研究揭示了其黏附功能的具体蛋白质身份。随着研究的积累，越来越明显的是，卵胶蛋白的类型和机制具有高度多样性，并且强烈依赖于物种特性。本研究旨在鉴定并表征两种Belostomatidae科水生昆虫A. japonicus和L. indicus的卵胶蛋白
数据可用性
本文报道的两种Belostomatidae科水生昆虫的卵胶蛋白全长序列已存储在GenBank数据库中。A. japonicus卵胶蛋白的GenBank登录号为“GenBank: PV738884”，L. indicus卵胶蛋白的登录号为“ENA: OZ311703.1”，后者是从L. indicus的基因组组装中获得的资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（项目编号RS-2021-NR060140和RS-2023-00243435）。
作者贡献
S.P.设计了实验。S.R.和N.K.负责卵胶蛋白的鉴定和重组表达。J-Y.Y.进行了与A. japonicus卵胶蛋白对应的L. indicus同源蛋白的生物信息学搜索。J.H.K.和S.C.从A. japonicus中提取了总RNA。所有作者共同分析了数据并共同撰写了论文。
CRediT作者贡献声明
权娜英：撰写——初稿、验证、实验研究。罗秀和：撰写——初稿、实验研究、正式分析。尹朱英：验证、数据管理。赵秀芝：实验研究。朴彩元：软件开发、实验研究。李世赫：撰写——审稿与编辑。金朱贤：撰写——审稿与编辑、实验研究。朴尚允：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、实验研究、资金筹集、概念构思。
