栉水母Mnemiopsis leidyi与马里兰沿海海湾致病性弧菌及有害藻华物种关联性研究

《Microbiology Spectrum》：Investigating the relationship between the comb jellyfish, Mnemiopsis leidyi, and the abundance of pathogenic Vibrio spp. and harmful algae species in the Maryland Coastal Bays

本研究通过为期两年的实地调查，揭示了栉水母（Mnemiopsis leidyi）在马里兰沿海海湾（MCBs）的分布及其与致病性弧菌（Vibrio spp.）和有害藻华（HABs）的生态关联。研究发现，水温是预测M. leidyi组织中创伤弧菌（V. vulnificus，vvhA+）的关键因子，而总溶解氮（TDN）最能预测水体中副溶血弧菌（V. parahaemolyticus，trh+）的丰度。该研究为MCBs区域弧菌预测模型的构建提供了重要的生物与非生物参数，对公共卫生风险管理具有重要指导意义。

　　

ABSTRACT

栉水母（Mnemiopsis leidyi）通过释放大量营养物质和有机物，刺激微生物生长并改变浮游生物群落结构。本研究于2021年4月至2022年6月期间，在马里兰沿海海湾（MCBs）的七个站点调查了M. leidyi的分布和丰度，及其与致病性弧菌（Vibrio）和有害藻华（HAB）物种的关联。研究同步采集了水样、M. leidyi样本，以及温度、盐度、溶解氧、营养盐和浊度等环境数据。结果显示，M. leidyi在两年内所有站点均有出现，但在高浊度水域（如怀特岛湾和纽波特湾）最为丰富。副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）和创伤弧菌（V. vulnificus）均在M. leidyi组织和水样中被检出，且与浊度呈中度正相关。HAB物种组成在不同站点间差异显著，例如甲藻卡尔藻（Karlodinium veneficum）在钦科蒂格湾占优势，而微微型浮游生物类群在纽波特湾更为突出。广义线性模型（GLM）分析表明，水温是预测M. leidyi组织中总（vvhA⁺）创伤弧菌的最佳指标，而总溶解氮（TDN）是预测水体中总（trh⁺）副溶血弧菌的最佳指标。M. leidyi丰度与HABs之间未发现强关联，但观察到M. leidyi组织中创伤弧菌与总甲藻生物量、M. leidyi丰度与甲藻生物量、以及M. leidyi组织中副溶血弧菌与微微型蓝藻生物量之间存在弱正相关。本研究为理解M. leidyi、弧菌属和HAB物种之间的关联提供了信息，有助于开发MCBs的弧菌预测模型。

IMPORTANCE

弧菌和藻华物种在海洋生态系统中自然存在，但某些弧菌和藻类可能对人类有害，引起肠胃炎等疾病。弧菌相关疾病在全球海洋环境中呈扩张趋势，许多研究将其与水温、营养盐和浮游生物华的增加联系起来。本研究观察到弧菌属、Mnemiopsis leidyi和HABs之间的季节性相互作用，并发现水温是总（vvhA⁺）创伤弧菌的最佳预测因子，而TDN是总（trh⁺）副溶血弧菌的最佳预测因子。这些发现为MCBs的HAB和弧菌属缓解策略及预测模型的开发提供了可用的生物和非生物因子。

INTRODUCTION

有害藻华（HAB）和弧菌属（Vibrio spp.）爆发的频率和生物丰度在美国正在增加，类似趋势在过去十年中也出现在中大西洋地区，特别是在切萨皮克湾和马里兰沿海海湾（MCBs）。这引发了人们对接触致病性弧菌（导致肠胃炎和血液感染）和产毒HABs的潜在风险的担忧，从而加强环境监测和创建或改进生物特异性预测模型的需求日益迫切。

MCBs由众多浅水、沿海、富营养化的泻湖组成，水体交换受限。自20世纪90年代末以来，营养盐浓度升高导致HABs反复发生、沉水植被丧失、溶解氧浓度降低以及整体水质恶化。与此同时，区域水域正在变暖，栉水母（Mnemiopsis leidyi）的华以及致病性弧菌物种（包括副溶血弧菌和创伤弧菌）的爆发和由此引发的弧菌病病例均在上升。然而，针对这三个类群之间生物学相互作用及相应水质参数的研究仍然有限。

弧菌是天然存在的革兰氏阴性海洋细菌，存在于从沿海到开阔水域的各种生境中。它们可以作为自由生活的生物或附着在有机颗粒和生物膜上生存。弧菌属是MCBs微生物群落的常见组成部分，其丰度在夏季达到峰值。许多HAB物种和M. leidyi种群在MCB中全年存在，最近的研究表明它们的种群在该区域正在增加，丰度峰值出现在春末夏初。特别令人担忧的是，自2012年以来，马里兰水域中一种异常强毒的副溶血弧菌菌株（O3:K6）的区域性增加，以及与创伤弧菌感染相关的高死亡率（35%）。

水温和盐度是水母和弧菌种群的重要驱动因素。因此，这些参数已被用于创建切萨皮克湾创伤弧菌和大西洋海荨麻（Chrysaora quinquecirrha）华的业务化预报模型。在MCBs，水温和盐度也限制着M. leidyi和弧菌属的种群，但其他因素如营养盐浓度可以刺激其丰度。由于弧菌属可以定殖和降解颗粒物，它们在化学转化（包括碳和营养循环）中扮演重要角色。有研究表明，刺激HABs的营养盐也可能对弧菌属和浮游植物之间的关联至关重要。类似地，M. leidyi也可以通过摄食利用和循环这些化合物的各种微生物来影响营养盐和碳浓度。由于弧菌属对多糖的亲和力，它们可能直接附着在M. leidyi上，和/或附着在M. leidyi摄食的浮游动物上。因此，栉水母的存在可能是弧菌丰度的一个驱动因素。

虽然弧菌与HAB物种之间以及弧菌与水母物种之间的关系已有研究，但三者之间的协同作用尚未被探讨。因此，本研究的目标是确定这三个生物类群在MCBs的分布和丰度。为此，M. leidyi和HAB物种通过形态特征进行鉴定，而副溶血弧菌和创伤弧菌则通过物种特异性和致病基因的分子检测进行鉴定。此外，我们检测了水体和M. leidyi组织中弧菌属的存在，以确定弧菌属、HABs和M. leidyi之间是否存在关系。最后，为了帮助改进用于预测或预警弧菌属存在的模型，我们检验了M. leidyi或HABs的存在是否可用于预测MCBs中弧菌属的存在。

MATERIALS AND METHODS

Sample collection and phytoplankton enumeration

于2021年和2022年的4月至10月期间，每月从MCBs的七个站点（图1）共采集95个水样、72个浮游植物样本和43个M. leidyi样本，用于弧菌和HAB的鉴定和计数。采样时间段覆盖春至秋季，旨在捕捉M. leidyi和弧菌丰度的变化，后者通常在夏季较温暖的月份增加。研究站点代表了MCBs的城市化北部区域（站点：S1和S2 [阿萨沃曼湾] 和 S4 [怀特岛湾]）和农村南部区域（站点：S9 [辛尼皮克森特湾]、S12 [纽波特湾] 和 S14 [钦科蒂格湾]），由海洋城入口（站点S8）分隔。这些站点的选择基于水质和M. leidyi及HAB物种相对丰度的差异。

每次采样时，使用Pro2030 YSI水质分析仪测量温度、盐度和溶解氧，并记录塞克盘深度。塞克盘深度根据Rasmussen等人的方法转换为浊度值（NTU）。使用公式：Secchi depth (ft) = 11.123 × x^?0.637。

使用1升Nalgene广口瓶从小于1米深度采集表面水抓取样，用于弧菌分析和水化学分析。在0.5米深度采集150毫升浮游植物样本，并立即用5%卢戈氏碘液固定。M. leidyi样本使用半气球拖网作为马里兰州自然资源部拖网调查的一部分进行采集。根据Doctor等人的方法，在深度>1.1米的水底部署16英尺半气球网板拖网，拖网时间为6分钟。每次拖网后，将500毫升M. leidyi样本收集在1升自封塑料袋中，储存在装有冰块的冷却器内，并在采集后6小时内处理。

使用奥林巴斯CKX41倒置显微镜检查浮游植物样本，重点进行HAB物种的鉴定和计数，遵循Marshall和Alden描述的改良Uterm?hl方法。本研究中鉴定的HAB物种与Glibert等人、Tango等人和Wolny等人报道的物种相对应。所有HAB物种均使用上述参考文献以及Tomas、Steidinger等人、Phlips等人和Tillmann等人的资料，尽可能鉴定到最低分类单元。细胞浓度记录为每升细胞数，并使用Hillebrand等人或Olenina等人的公式转换为生物量。为本研究目的，我们确定了与Marshall等人和Marshall与Egerton提出的区域阈值一致的华浓度：甲藻华为10⁵cells L^?1，硅藻华为10⁵cells L^?1，微微型浮游生物为10⁷cells L^?1，存在一些物种特异性例外。

Quantification of Vibrio parahaemolyticus and V. vulnificus

水样和M. leidyi样本均按照Esteves等人和Blodgett的三管法进行最可能数（MPN）分析。基于美国食品药品监督管理局《细菌学分析手册》（BAM）的MPN用于计算副溶血弧菌和创伤弧菌的丰度。将M. leidyi样本倒入无菌滤网中，用饮用水冲洗。使用无菌镊子，挑选个体M. leidyi加入无菌搅拌杯，直至总重达到25克。在搅拌杯中加入等量的磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后高速搅拌90秒。搅拌后，将1毫升M. leidyi匀浆一式三份接种到9毫升碱性蛋白胨水（APW）肉汤中，在35°C下静置培养过夜。将未稀释水样的系列体积（100 mL、10 mL、1 mL、100 μL、10 μL和1 μL）一式三份接种到10毫升APW肉汤中，在35°C静置培养过夜。培养后，将所有样本的1毫升转移到微量离心管中，在100°C干浴中煮沸10分钟，然后储存在-80°C直至进行实时PCR分析。

使用实时PCR方法进行弧菌属分析，靶向物种特异性基因tlh（不耐热溶血素）以估算总副溶血弧菌的丰度，靶向物种特异性基因vvhA（创伤弧菌溶血素A）以确认水体中总创伤弧菌的丰度。靶向tdh⁺（耐热直接溶血素）和trh⁺（耐热相关溶血素）以确定副溶血弧菌中毒力基因的存在。靶向vcgC⁺（毒力相关基因）以确定创伤弧菌中毒力基因的存在。这些反应所用的引物、探针和内部对照如Panicker和Bej、Nordstrom等人以及Baker-Austin等人所述。

使用国家贝类卫生计划（NSSP）指南和Applied Biosystem 7500 FAST实时PCR系统检测tlh、tdh⁺、trh⁺和vvhA基因。反应浓度和条件如下：每种引物0.5–0.75 μL，每种探针0.188–0.5 μL，缓冲液（Invitrogen）2.5 μL，MgCl₂（Invitrogen）2.5 μL，dNTP溶液（Sigma Aldrich）0.75 μL，无核酸酶PCR级水11.8 μL，铂金Taq聚合酶（Invitrogen）0.45 μL，ROX（Thermo Fisher）0.06 μL，内部扩增对照（BioGX）2.0 μL，以及DNA模板（煮沸的MPN培养物）2.0 μL，总体积25 μL。反应程序为：初始变性/聚合酶激活95°C 60秒，随后进行45个循环的95°C 5秒和退火温度（vvhA为57°C，tlh、tdh⁺和trh⁺为59°C）45秒。

使用iTaq Universal Supermix（Bio-Rad Laboratories）检测vcgC⁺，如Panicker等人和Lane等人所述，使用Bio-Rad CFX96 RT PCR系统，反应程序为：初始变性/聚合酶激活95°C 180秒，随后进行45个循环的95°C 5秒和退火温度60°C 45秒。

Nutrient analysis

用于营养盐分析的水样120 mL通过Sterivex滤芯（0.22 μm, Millipore, Merck）过滤，使用50 mL Luer-Lock注射器（BD Medical）进行。滤液储存于-80°C直至分析。总溶解氮（TDN）、总溶解磷（TDP）、硝酸盐/亚硝酸盐（NO₃:NO₂）、亚硝酸盐（NO₂^-）、铵（NH₄⁺）和正磷酸盐（PO₄^3-）的浓度由切萨皮克生物实验室（Solomons, MD, USA）使用Technicon Auto Analyzer II（SEAL Analytical Inc.）和NAP软件进行分析，遵循美国环境保护署的方法，并经过切萨皮克湾项目的修改。

Statistical analysis

所有统计分析均使用RStudio version 3.3.0进行。弧菌属和HAB物种计数数据经过对数转换以标准化数据分布。使用Ggmaps创建站点地图，整合了来自Google Maps的底图。使用RStudio中的单因素方差分析（one-way ANOVA）评估M. leidyi、HABs、弧菌属、营养盐、生物量和环境参数之间的关系。使用RStudio中的ggplot2包生成M. leidyi、HABs、弧菌属和环境参数分布的可视化图表。使用Spearman相关性检验和Benjamini and Hochberg P值校正来评估M. leidyi、弧菌属、营养盐、HABs和环境参数之间的关联。本研究中的季节根据区域气候/天气模式以及浮游植物和鱼类种群定义为春季（4月–6月）和夏季（7月–10月）。由于鞭毛藻类在研究区域不常见，将其数据从季节性相关分析中移除。最初，所有微微型浮游生物类群（>3 μm）被归类在一起。然而，由于不同的环境偏好和生态系统干扰模式，微微型浮游生物类群被单独分析为棕潮藻（Aureococcus anophagefferens）、Pedinophyceae和微微型蓝细菌。使用相关图（RStudio中的Corrgram包）生成环境因素之间关系的可视化表示，并帮助确定建模时使用的变量。

使用广义线性模型（GLMs）描述弧菌属与环境变量之间的相关性。环境样本中的弧菌属标记作为响应变量，环境参数作为每个模型中使用的解释变量。每个模型的组合见表1和表2。使用RStudio中的MuMIn包计算AICc准则以对模型进行排序。AICc是一种用于模型选择的统计方法，有助于识别最符合数据的模型。响应变量是M. leidyi组织中的vvhA⁺创伤弧菌和trh副溶血弧菌，固定变量是环境参数，包括营养盐。模型包含非生物和生物变量。此外，在R studio中使用base R和sensitivity包评估模型的拟合度，以评估模型的可靠性以及模型预测受输入变量变化影响的程度。具体来说，我们计算了估计系数和每个预测变量增加10%导致的模型预测百分比变化。

RESULTS

Comparison of environmental parameters

在所有七个MCBs站点（图1）测量了非生物参数以确定站点间的相对水质。水温、盐度、溶解氧、浊度和营养盐浓度的平均值和范围见表3和表4。单因素方差分析显示站点间温度无显著差异（表S1）。盐度范围在19至36 PSU之间，由于海洋城入口的影响，站点S14、S8和S4记录的盐度值较高，而S12记录的盐度值最低。总体而言，2022年的盐度高于2021年。站点间和年份间的盐度存在显著差异，P < 0.05（表3和表4；表S1）。

溶解氧水平在各站点间相似，平均在6.2至6.8 mg mL^?1之间。浊度范围从0.001到34.10 NTU。平均浊度在站点S12（16.6 NTU）和S4（11.8 NTU）最高。单因素方差分析显示溶解氧水平无显著差异，但站点间的浊度值存在差异，P < 0.05（表3和表4；表S1）。

营养盐浓度见表3和表4。单因素方差分析显示，TDN（0.11–1.10 μM）、NO₃^-:NO₂（0.01–0.48 μM）和NH₄⁺（0.01–0.29 μM）浓度在年份间无显著差异。然而，TDN、NO₃^-:NO₂和NH₄⁺浓度在站点间存在显著差异，P < 0.05。平均TDN浓度在站点S1和S2（均为0.58 μM）以及站点S12（0.54 μM）最高。平均NO₃^-:NO₂浓度在站点S1和S2（均为0.03 μM）以及站点S9（0.05 μM）最高。平均NH₄⁺浓度在站点S1（0.08 μM）和S2（0.06 μM）最高。PO_4-（0–0.62 μM）和TDP（0.01–0.83 μM）浓度在年份间也存在显著差异，P < 0.05。平均PO_4-和TDP浓度在2022年高于2021年，而PO_4-和TDP浓度在站点间无显著差异（表3和表4；表S1）。

HAB species distribution in the MCBs

MCBs中鉴定的HAB物种的站点分布见图S1a。具有已知有害效应的HAB物种列表见表S2。MCB北部站点（S1、S2和S4）具有持续的华形成甲藻种群，如Levanderina fissa、Akashiwo sanguinea和Gymnodinium aureolum。潜在有毒或有害的硅藻，如伪菱形藻属（Pseudo-nitzschia spp.）和Proboscia alata，在海洋城入口附近的站点（S8和S9）最为丰富。纽波特湾站点（S12）的浮游植物群落中微微型细胞（2–3 μm）比例较高，包括微微型蓝细菌、一种未鉴定的Pedinophyceae物种和棕潮生物棕潮藻（Aureococcus anophagefferens），与其他HAB物种和其他研究站点相比（图S1）。鱼毒性甲藻卡尔藻（Karlodinium veneficum）是在钦科蒂格湾（S14）发现的最丰富的HAB物种。华形成甲藻微小原甲藻（Prorocentrum minimum）和纤毛虫红色中缢虫（Mesodinium rubrum）在本研究期间遍布MCBs，后者在鳍藻属（Dinophysis）甲藻的生命周期中起着至关重要的作用，并可作为鳍藻华的预测指标。

单因素方差分析表明，站点间的HAB浓度无显著差异。然而，微微型浮游生物、硅藻和甲藻的生物量在年份和月份间存在显著差异，P值 < 0.05（图2和表S1）。总微微型蓝细菌生物量为0.73 × 10¹μgC L^?1（2022年9月观测到最大值），硅藻为0.18 × 10¹μgC L^?1（2022年9月观测到最大值），甲藻为7.2 × 10³μgC L^?1（2021年9月观测到最大值）。

Mnemiopsis leidyi distribution in MCBs

M. leidyi丰度的季节和时间变化见图3。M. leidyi在6月至8月最为丰富，浓度在站点S4和S14最高。单因素方差分析显示站点间的丰度存在显著差异，P < 0.05（表4）。然而，年份间的M. leidyi丰度无显著差异（表S1）。

Vibrio parahaemolyticus prevalence in water and Mnemiopsis leidyi tissues

使用物种特异性和致病基因检测的水样和M. leidyi组织中副溶血弧菌的浓度和检出率列于表5。不耐热溶血素（tlh）副溶血弧菌基因在70%的水样中检出，浓度范围从0.01到3.72 log MPN mL^?1。在匀浆的M. leidyi组织样本中，tlh副溶血弧菌基因在56%的样本中检出，浓度范围从0.44到4.90 log MPN g^?1。致病性耐热直接溶血素阳性（tdh⁺）副溶血弧菌基因在15%的水样和5%的匀浆M. leidyi组织样本中检出。水样中tdh⁺副溶血弧菌基因的浓度范围从0.01到0.28 log MPN mL^?1，匀浆M. leidyi组织中从0.28到1.85 log MPN g^?1。致病性耐热相关溶血素阳性（trh⁺）副溶血弧菌基因在16%的水样和28%的匀浆M. leidyi组织样本中检出。水样中trh⁺副溶血弧菌基因的浓度范围从0.01到1.87 log MPN mL^?1，匀浆M. leidyi组织中从0.49到4.06 log MPN g^?1（表5）。水样中总tlh⁺副溶血弧菌基因在年份间存在显著差异，2021年检测到的副溶血弧菌多于2022年（P < 0.05；表6）。

tlh副溶血弧菌基因每月均在水样中检出，但最高浓度出现在7月至9月（图4a）。tlh副溶血弧菌基因在所有七个站点均被检出，但水样中的最高浓度出现在站点S1和S12（图4b）。tdh⁺副溶血弧菌基因在6月至9月以低浓度在站点S1、S9和S12检出，trh⁺副溶血弧菌基因在6月至10月以低浓度在站点S1、S2、S4和S12检出（图4）。

tlh⁺副溶血弧菌基因在5月至10月采集的匀浆M. leidyi组织中检出，最高浓度出现在6月（图5a），并在所有站点检出，最高浓度出现在站点S9（图5b）。tdh⁺副溶血弧菌基因在任何月份或站点均未检出，但trh⁺基因在6月至9月于站点S2、S4、S8、S9和S12检出，最高浓度出现在6月和站点S8（图5）。

Vibrio vulnificus prevalence in water and Mnemiopsis leidyi tissues

使用物种特异性和致病基因靶点检测的水样和M. leidyi组织中创伤弧菌的浓度和检出率列于表5。创伤弧菌溶血素A基因（vvhA）在20%的水样中检出，浓度范围从0.02到1.40 log MPN mL^?1。vvhA标记在33%的匀浆M. leidyi组织样本中发现，浓度范围从0.05到2.11 log MPN g^?1。使用弧菌毒力相关临床基因（vcgC⁺），创伤弧菌在1%的水样中检出，浓度范围从0.00到0.03 log MPN mL^?1。vcgC⁺基因在8%的M. leidyi组织样本中检出，浓度范围从0.30到2.04 log MPN g^?1。总（vvhA）创伤弧菌在年份间存在显著差异，2021年检测到的创伤弧菌浓度更高（P < 0.05；表6）。

vvhA创伤弧菌基因在6月、7月、8月和10月采集的水样中检出，最高浓度出现在8月（图4a）。vvhA创伤弧菌基因在所有站点的水样中检出（S14除外）。最高vvhA创伤弧菌基因浓度在站点S12检测到（图4b）。vcgC⁺创伤弧菌基因在任何月份或站点的水样中均未