《Horticulture Research》：Targeting and activation of BraATG8i by an RxLR effector DM459 contribute to downy mildew resistance in Brassica rapa
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为解决霜霉病抗性机制不清的问题，研究人员开展了H. parasitica RxLR效应子DM459的功能研究。结果发现DM459通过直接靶向BraATG8i并增强其与BraATG4/7的互作，从而激活自噬通路；同时，DM459还诱导水杨酸(SA)信号，形成正反馈环路，共同增强植物对霜霉病的抗性。该研究首次揭示了卵菌效应子通过激活自噬增强植物免疫的新机制，为作物抗病育种提供了新靶点。
论文解读
在蔬菜种植中，霜霉病是白菜、甘蓝等十字花科作物最令人头疼的病害之一。这种由卵菌纲病原菌Hyaloperonospora parasitica引起的病害，在适宜条件下可导致作物减产超过50%，严重威胁全球蔬菜生产。尽管育种家们已经通过遗传定位找到了一些抗病基因位点，但植物与病原菌之间“攻防战”的具体分子细节，特别是病原菌如何利用“武器”（效应子）来操控植物细胞，以及植物如何识别并反击这些“武器”的机制，至今仍有许多未解之谜。
为了在这场看不见的战争中占据先机，科学家们将目光投向了病原菌分泌的一类关键“武器”——RxLR效应子。这类蛋白因其N端含有一个保守的Arg-x-Leu-Arg（RxLR）基序而得名，它们被病原菌注入植物细胞后，能够精准地“劫持”植物的免疫系统，帮助病原菌建立侵染。然而，有趣的是，并非所有效应子都是“帮凶”，有些效应子会被植物的抗病蛋白识别，从而触发强烈的免疫反应，反而成为植物防御的“警报器”。因此，深入解析这些效应子的功能，对于理解植物免疫和开发新型抗病策略至关重要。
与此同时，细胞内的“清道夫”——自噬（Autophagy）在植物抗病中的作用也日益受到关注。自噬是细胞在逆境下通过降解自身受损或多余的组分来维持稳态的重要过程。近年来的研究发现，自噬在植物抵抗病原菌侵染中扮演着双重角色：一方面，它可以清除被病原菌破坏的细胞器，限制病原菌的扩散；另一方面，它也能调节免疫相关的细胞死亡，防止过度反应对植物造成伤害。自噬过程的核心蛋白ATG8，就像是一个“分子标签”，负责招募需要被降解的“货物”到自噬体中。越来越多的证据表明，病原菌的效应子会直接靶向ATG8，从而干扰自噬介导的免疫。然而，在卵菌与十字花科作物的互作体系中，效应子如何通过调控自噬来影响植物抗病性，仍是一个待探索的领域。
为了回答这些问题，来自北京市农林科学院蔬菜研究所、国家蔬菜改良中心等机构的研究团队在《Horticulture Research》上发表了一项研究。他们从侵染白菜的霜霉病菌H. parasitica中鉴定到一个RxLR效应子DM459，并发现这个效应子非但没有帮助病原菌侵染，反而能够激活植物的自噬通路，从而增强植物对霜霉病的抗性。该研究揭示了DM459通过直接结合自噬核心蛋白BraATG8i，并促进其与BraATG4、BraATG7等蛋白的互作，从而促进自噬体形成；同时，DM459还能诱导水杨酸（SA）信号通路，形成一个正反馈环路，共同增强植物免疫。这一发现不仅为理解植物-病原菌互作提供了新的视角，也为利用效应子基因进行作物抗病育种提供了新的思路。
关键技术方法
本研究主要采用了分子生物学、生物化学和植物病理学相结合的技术手段。研究人员首先通过酵母信号肽捕获系统验证了DM459的分泌功能，并利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位和细胞死亡诱导分析。为了鉴定DM459的宿主靶标，他们构建了酵母双杂交（Y2H）文库进行筛选，并通过双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（Co-IP）等多种体内外实验验证了蛋白互作。通过构建过表达和RNAi转基因白菜植株，结合病原菌接种和自噬抑制剂处理，评估了BraATG8i在抗病中的功能。此外，还利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测了水杨酸含量，并通过酵母单杂交（Y1H）和启动子活性分析等手段，阐明了SA信号通路对BraATG8i表达的调控机制。
研究结果
2.1 DM459是H. parasitica的一个RxLR效应子
研究人员首先从H. parasitica中鉴定出DM459，其编码的蛋白含有N端信号肽和RxLR基序，符合RxLR效应子的特征。酵母分泌实验证实DM459具有分泌功能。在烟草中瞬时表达DM459-GFP融合蛋白，发现其定位于细胞质、细胞核和质膜，并在细胞质中形成点状聚集。更重要的是，在白菜子叶中瞬时表达DM459能够诱导细胞死亡，并显著增强植物对H. parasitica的抗性，表明DM459是一个能够激活植物免疫的效应子。
2.2 效应子DM459与自噬蛋白BraATG8i互作
为了寻找DM459在植物细胞内的作用靶点，研究人员利用酵母双杂交（Y2H）技术筛选白菜cDNA文库，发现DM459与一个自噬相关蛋白BraATG8i存在互作。通过BiFC、LCI和Co-IP等实验，在体内外均证实了DM459与BraATG8i的直接物理互作。表达分析显示，H. parasitica侵染能够诱导BraATG8i的表达，且抗病品种中的表达量显著高于感病品种。亚细胞定位显示BraATG8i定位于细胞核和细胞质膜。此外，DM459还能与多个BraATG8家族成员互作，表明其作用具有一定的广谱性。
2.3 DM459诱导自噬并提高白菜对霜霉病的抗性
为了探究自噬在抗病中的作用，研究人员用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理白菜叶片，发现抑制自噬会显著增加植物对H. parasitica的感病性。通过单丹磺酰尸胺（MDC）染色和透射电镜（TEM）观察，发现DM459的表达能够显著诱导自噬体的形成。这些结果表明，DM459通过诱导自噬来增强植物的抗病性。
2.4 BraATG8i是植物免疫的正调控因子
为了验证BraATG8i在抗病中的功能，研究人员构建了BraATG8i过表达和RNAi转基因白菜植株。结果显示，过表达BraATG8i能够显著增强感病品种对H. parasitica的抗性；而通过RNAi技术沉默BraATG8i的表达，则会使抗病品种变得感病。这些遗传学证据表明，BraATG8i是白菜抵抗霜霉病的一个正调控因子。
2.5 DM459还与BraATG4、BraATG3和BraATG7互作
自噬体的形成是一个复杂的过程，涉及ATG8与ATG4、ATG7、ATG3等多个核心蛋白的互作。研究人员发现，DM459不仅与BraATG8i互作，还能与BraATG4、BraATG3和BraATG7直接结合。这表明DM459可能通过同时靶向多个自噬核心蛋白，来更有效地调控自噬过程。
2.6 DM459显著增强ATG8i与所选ATG蛋白的互作
为了探究DM459如何调控自噬，研究人员进行了免疫共沉淀（Co-IP）和酵母三杂交（Y3H）实验。结果发现，DM459的存在能够显著增强BraATG8i与BraATG4、BraATG7之间的互作。这表明DM459可能作为一个“分子胶水”，促进自噬核心复合物的组装，从而促进自噬体的形成。
2.7 DM459通过SA信号通路部分激活自噬
水杨酸（SA）是植物抗病信号通路中的关键激素。研究人员发现，H. parasitica侵染或DM459的表达均能诱导SA的积累，且抗病品种中的SA水平更高。SA处理能够诱导BraATG8i的表达。进一步分析发现，抗病品种中BraATG8i的启动子区域比感病品种多了一个as-1顺式作用元件，该元件是SA信号通路中TGA转录因子的结合位点。通过酵母单杂交（Y1H）和荧光素酶报告基因实验，证实了BraTGA转录因子能够结合BraATG8i的启动子并激活其表达。这些结果表明，DM459诱导的自噬部分是通过激活SA信号通路来实现的。
结论与讨论
本研究首次在H. parasitica与白菜的互作体系中，鉴定并功能解析了一个能够激活植物免疫的RxLR效应子DM459。该研究揭示了DM459通过直接靶向自噬核心蛋白BraATG8i，并增强其与BraATG4、BraATG7等蛋白的互作，从而促进自噬体形成，增强植物对霜霉病的抗性。同时，DM459还能诱导SA信号通路，形成一个正反馈环路，进一步放大免疫反应。
这一发现具有重要的科学意义。首先，它揭示了一种新的植物-病原菌互作模式：病原菌的效应子并非总是抑制免疫，有些效应子可以被植物利用来激活免疫。其次，该研究首次报道了卵菌效应子通过激活自噬来增强植物抗性的分子机制，这与之前报道的许多抑制自噬的效应子形成了鲜明对比，体现了植物与病原菌在进化过程中的“军备竞赛”。最后，该研究不仅鉴定了一个新的抗病基因BraATG8i，还阐明了其上游的调控机制（SA信号和TGA转录因子），为通过分子育种手段提高白菜及其他十字花科作物的抗病性提供了坚实的理论基础和候选基因。
