《Nucleic Acids Research》：PexR is a noncanonical regulator of the peroxide stress response in bacteria
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本刊推荐：为揭示缺乏经典OxyR/PerR转录因子的细菌如何应对过氧化物应激，研究人员以粘细菌Myxococcus xanthus为模型，发现了一种新型细菌增强子结合蛋白PexR。该蛋白通过其N端GAF结构域感知H2O2并释放结合金属，从而解除自抑制状态，进而作为双功能阻遏-激活因子调控过氧化物酶ahpC和过氧化氢酶katB的σ54依赖性表达。此发现不仅拓展了原核生物氧化应激应答的调控工具箱，也为遗传编码的H2O2传感器开发提供了新元件。
在生命世界的微观战场上，氧气既是能量代谢的必需元素，也是潜在的危险源——其代谢过程会产生活性氧物种（ROS），如过氧化氢（H2O2），这些高活性分子能对细胞组分造成严重损伤。为了应对这一挑战，细菌进化出了精妙的防御系统，其中过氧化物氧化还原蛋白（如AhpC）和过氧化氢酶是中和H2O2的关键卫士。数十年来，科学界公认的细菌过氧化物应激应答“经典范式”由两个主要的转录调控因子主导：OxyR和PerR。OxyR广泛存在于革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌中，通过其保守的半胱氨酸残基感知H2O2并发生二硫键形成，从而改变其构象和DNA结合活性，激活或抑制靶基因表达。PerR则主要存在于革兰氏阳性厚壁菌门，利用其结合的非血红素铁（Fe2+）通过芬顿反应产生羟基自由基，氧化组氨酸残基，进而丧失DNA结合能力，解除对靶基因的抑制。绝大多数细菌拥有其中一种或同时拥有这两种调控系统。
然而，自然界的微生物多样性远超我们的想象。粘细菌（Myxobacteria），现被重新分类为粘球菌门（Myxococcota），是一类具有复杂多细胞行为的革兰氏阴性土壤细菌。它们不仅是自然界重要的分解者，还是次级代谢产物的宝库，并能进行类似真核生物的社会性运动、子实体形成和捕食行为。作为严格好氧菌，粘细菌在其生活史中不可避免地面临各种氧化应激，包括由光照产生的单线态氧（1O2）以及代谢产生的H2O2等。尽管对光照引发的单线态氧应激反应已有较深入研究，但粘细菌如何应对过氧化物应激一直是个谜团。令人困惑的是，对模式菌株Myxococcus xanthus DK1622大型基因组的分析表明，它缺乏具有典型H2O2感知关键残基的OxyR或PerR同源物。那么，这类拥有复杂生命形式的细菌究竟采用何种独特的机制来感知过氧化物信号并启动防御反应？这个悬而未决的问题激发了研究人员的浓厚兴趣。
为了解决这一科学问题，由西班牙穆尔西亚大学、马德里Blas Cabrera物理化学研究所以及美国麻省理工学院和霍华德·休斯医学研究所的研究人员组成的国际合作团队，在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上发表了他们的最新发现。他们揭示了一种全新的、不依赖于OxyR/PerR的过氧化物应激调控机制，其核心是一个名为PexR（Peroxide Regulator）的细菌增强子结合蛋白（bacterial enhancer binding protein, bEBP）。
为开展此项研究，研究人员综合运用了分子微生物学、生物化学、结构生物学和生物信息学等多种关键技术。主要包括：在Myxococcus xanthus中通过两步等位基因交换进行基因敲除和条件性表达，以研究基因功能；利用RNA测序（RNA-seq）和定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析转录组变化；通过染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证蛋白质与DNA的直接相互作用；采用蛋白质纯化、尺寸排阻色谱、等温滴定 calorimetry（ITC）、化学交联和金属含量分析（ICP-MS、比色法）来表征PexR及其结构域的生化特性、寡聚化状态、ATP结合能力及金属结合性质；利用细菌双杂交（BACTH）分析蛋白质相互作用；并通过低温电子显微镜（cryo-EM）初步解析了PexR关键结构域的二聚体结构。此外，还利用HyPer7遗传编码探针监测细胞内H2O2水平，并通过基因组比对分析PexR调控机制在粘球菌门及其他细菌门中的进化保守性。
Myxococcus xanthus缺乏典型的OxyR或PerR同源物
研究人员首先通过PSI-BLAST搜索验证了之前的推测：M. xanthus基因组中确实不存在具有H2O2感知关键残基的OxyR或PerR同源物，表明其过氧化物应激应答存在非经典调控路径。
ahpC基因的缺失引起多效性效应并增强对外源H2O2的耐受性
为了探究核心防御元件AhpC的功能，研究人员构建了ahpC基因的框内缺失突变株（ΔahpC）。该突变株表现出生长迟缓、菌落变小且颜色变为橙色、平板效率降低等多效性缺陷。利用遗传编码的H2O2传感器HyPer7检测发现，ΔahpC细胞内源H2O2水平显著升高（约5倍）。有趣的是，在纸片扩散实验中，ΔahpC菌株反而对外源H2O2表现出更强的耐受性，并伴有气泡产生，暗示可能存在过氧化氢酶的补偿性诱导。转录组分析显示，ΔahpC菌株中约有25%的基因表达发生改变，其中最为显著上调的基因是编码预测的过氧化氢酶KatB（MXAN_4389）及其伴侣蛋白AnkB的基因，以及ahpC所在操纵子的其他成员（ahpD, dps）和其反向转录的邻接基因（MXAN_1565，即后来的pexR）。这些结果表明，在缺乏AhpC的情况下，细胞内H2O2水平升高触发了一个广泛的应激反应，其中katB等基因的强烈上调很可能是其耐受外源H2O2的原因。
AhpC与PexR或KatB的同时缺失导致合成致死
为了理解ahpC、katB和pexR之间的关系，研究人员尝试构建双缺失突变株。结果表明，ΔahpC ΔkatB和ΔahpC ΔpexR双突变体无法获得，呈现出合成致死表型，即同时缺失AhpC和KatB或AhpC和PexR对细胞是致命的。这提示AhpC的功能与其PexR介导的KatB协同调控对于M. xanthus的生存至关重要。后续实验证实，PexR是内源（ΔahpC导致）和外源H2O2应激下诱导katB和ahpC表达所必需的。
PexR直接介导katB和ahpC的σ54依赖性激活并下调ahpC的σA依赖性表达
通过启动子-报告基因融合（lacZ）、ChIP-qPCR和EMSA等实验，研究人员证实PexR能够直接结合到katB和ahpC的上游调控区。对katB启动子区的分析发现了一个典型的σ54依赖性启动子，其上游存在三个完美的中断回文重复序列（CACCG-n6-CGGTG），作为PexR的结合位点（上游激活序列，UAS）。对ahpC启动子区的分析则更为复杂：在正常条件下，ahpC主要从一个σA型启动子表达，而PexR结合在重叠于该启动子的UAS上，起阻遏作用，抑制其基础表达；在过氧化物应激下（如ΔahpC背景或H2O2处理），PexR则激活其下游另一个σ54依赖性启动子的表达。因此，PexR是一个双功能转录调控因子，既是无应激条件下ahpC σA启动子的阻遏物，又是过氧化物应激下ahpC和katB σ54启动子的激活物。
GAF结构域负调控PexR活性且为H2O2感知所必需
PexR是一个典型的bEBP，包含N端调控结构域（R，此处为GAF结构域）、中央AAA+ ATP酶结构域和C端DNA结合结构域（DBD）。研究发现，缺失GAF结构域的PexR（PexRΔGAF）即使在无H2O2应激条件下也能组成性激活katB表达，表明GAF结构域在无应激时抑制PexR的活性。细菌双杂交实验显示GAF结构域能与PexRΔGAF发生物理相互作用，但在反式（trans）表达时，GAF结构域虽能抑制PexRΔGAF的活性，却无法被外源H2O2逆转其抑制效应，提示正确的H2O2信号传导需要GAF结构域以顺式（cis）方式与PexR的其余部分相连。
PexR二聚体GAF结构域中的Zn2+/Fe2+结合中心决定H2O2感知
生化分析表明，纯化的全长PexR及其GAF结构域或GAF-AAA+片段能够结合锌（Zn2+）和铁（Fe2+）。SEC和化学交联实验证实PexR GAF-AAA+主要以二聚体形式存在，并能形成更高级别的寡聚体。低温电镜分析初步解析了Fe2+重构的GAF-AAA+二聚体的低分辨率结构，其形状与AlphaFold3预测的模型一致。通过定点突变GAF结构域中预测的金属结合口袋残基（如H102, H120, C122, D140），发现这些突变体即使在没有H2O2的情况下也能激活katB表达，并且其金属结合能力受损。比色法实验进一步证实，H2O2处理能导致GAF结构域释放其结合的Zn2+，或导致Fe2+重构的GAF-AAA+释放Fe2+。这些结果强有力地支持了以下模型：PexR的GAF结构域通过其结合的金属（Zn2+或Fe2+）维持PexR处于自抑制的静止状态；当H2O2存在时，GAF结构域感知信号并释放金属，从而解除抑制，激活PexR。
PexR调控过氧化物应激反应的进化保守性
生物信息学分析显示，PexR同源物及其调控元件（如ahpC上游的σ54启动子和PexR结合位点）在粘球菌门的大多数物种中高度保守。值得注意的是，在一些粘细菌中，PexR调控机制与经典的OxyR或PerR系统共存，显示出该门类细菌在过氧化物应激调控策略上的显著多样性。此外，在粘球菌门之外的某些细菌门（如酸杆菌门、硝化螺旋菌门等）中也发现了PexR的同源物，表明这种新型调控机制可能具有更广泛的分布。
本研究结论揭示了一种全新的细菌过氧化物应激应答调控范式。PexR作为首个被发现的感知H2O2的细菌增强子结合蛋白，通过其GAF结构域的金属结合/释放机制感知信号，并以双功能（阻遏-激活）方式精细调控关键解毒基因（ahpC, katB）的σ54依赖性转录。这种机制独立于经典的OxyR和PerR系统，丰富了我们对原核生物应对氧化环境胁迫多样性的认知。该研究的深刻意义在于：首先，它解决了M. xanthus这类重要模式生物中过氧化物应激调控机制的长期谜团，将bEBP/σ54调控通路与过氧化物防御联系起来。其次，PexR的金属依赖性H2O2感知机制为理解信号感知蛋白的进化提供了新视角，并与已知的NorR（NO传感器）等存在有趣的平行关系。再者，该机制在粘球菌门内的广泛保守性及其在某些物种中与OxyR/PerR的共存现象，提示了细菌在面对相同环境压力时可能采用多种、甚至冗余的调控策略以增强适应性，这反映了微生物进化过程中的复杂性和灵活性。最后，PexR作为一种新型的H2O2传感蛋白，为开发遗传编码的H2O2生物传感器提供了新的分子工具，具有潜在的应用前景。总之，这项研究突破了细菌过氧化物应激应答的经典范式，开辟了该领域新的研究方向。
