AMPKα2通过促进NCOA4的降解，减轻三阴性乳腺癌中多柔比星诱导的铁死亡（ferroptosis）现象

《eBioMedicine》：AMPKα2 attenuates doxorubicin induced ferroptosis by promoting NCOA4 degradation in triple negative breast cancer

AMPKα2通过磷酸化NCOA4激活CMA通路降解其蛋白，抑制铁依赖性脂质过氧化介导的F ferroptosis，为克服TNBC化疗耐药提供新靶点。

　　

刘新军|司子珍|李林波|周淼|李基勇|王希迪

中国浙江省宁波市宁波大学第一附属医院中央实验室

摘要

目的

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性强的乳腺癌类型，治疗选择有限且常出现化疗耐药性。AMPK催化α亚基2（AMPKα2）与多种癌症的化疗耐药性发展有关。然而，AMPKα2在TNBC中对多柔比星（DOX）耐药性的作用仍有待研究。

方法

通过Western blotting检测DOX耐药性TNBC中的AMPKα2水平。通过脂质过氧化、细胞内铁含量、MDA和GSH检测方法评估AMPKα2在DOX诱导的铁死亡（ferroptosis）中的作用。采用Western blotting、qRT-PCR、共免疫沉淀（co-IP）、免疫荧光染色和KFERQ-mCherry报告基因检测技术来探讨AMPKα2的作用及其与NCOA4降解的关联。

结果

在DOX耐药性TNBC细胞中，上调的是AMPKα2而非AMPKα1。AMPKα2通过抑制NCOA4来抑制DOX诱导的铁死亡。AMPKα2在S151位点磷酸化NCOA4，这增强了HSC70对NCOA4的识别，并促进了NCOA4/HSC70/LAMP-2A复合物的形成，从而启动CMA途径介导的NCOA4降解。S151A突变或AMPKα抑制剂会消除这些生物学效应，并增加细胞对DOX诱导的铁死亡的敏感性。

结论

AMPKα2通过S151位点磷酸化NCOA4来抑制DOX诱导的铁死亡，进而促进其CMA途径介导的降解。靶向AMPKα2可能是克服TNBC患者DOX耐药性的潜在策略。

引言

乳腺癌（BC）是一种影响女性健康的常见恶性肿瘤。三阴性乳腺癌（TNBC）约占所有乳腺癌的20%，其临床行为具有侵袭性且预后较差（Liu等人，2024a）。由于缺乏雌激素（ER）和孕激素受体（PR）以及人表皮生长因子受体2（HER2），TNBC对内分泌和靶向治疗具有抗性（Choupani等人，2023）。因此，化疗仍然是主要的治疗手段。虽然大多数TNBC患者最初对化疗有反应，但超过50%的患者会发展出化疗耐药性，导致复发、转移和死亡率增加（Inayatullah等人，2024）。化疗耐药机制的复杂性引发了大量研究兴趣，但许多潜在因素仍不清楚。

AMP激活的蛋白激酶（AMPK）在调节细胞能量和营养物质的代谢中起核心作用（Malik和Shaw，2025）。AMPK由一个催化α亚基、一个调节β亚基和一个γ亚基组成，形成一个异三聚体复合物（Huynh等人，2023）。AMPK的两种α亚基——AMPKα1和AMPKα2分别由PRKAA1和PRKAA2编码，它们的氨基酸序列有约75%的相似性（Steinberg和Hardie，2023）。先前的研究描述了AMPK信号通路通过不同机制发挥肿瘤抑制作用，包括抑制mTOR信号通路、下调糖酵解途径或抑制上皮-间充质转化（EMT）以抑制癌症转移（Shackelford和Shaw，2009；Chen等人，2022）。然而，最近的研究表明AMPK可以减轻代谢应激并促进癌细胞存活。能量应激介导的AMPK激活会抑制铁死亡（Lee等人，2020）。AMPKα2磷酸化ULK1，这是一种关键的自噬诱导因子，从而在应激条件下促进自噬和癌细胞存活及化疗耐药性（Fang等人，2022；Rao等人，2017）。AMPK信号通路的激活对TNBC从代谢应激中恢复至关重要（Lo等人，2023），并且AMPKα2在化疗和肺癌转移期间对TNBC细胞存活是不可或缺的（Cheng等人，2023）。值得注意的是，大多数研究仅关注AMPKα，而没有区分观察到的生物学功能是由AMPKα1还是AMPKα2引起的。由于有关AMPK信号通路在TNBC中作用存在争议，因此需要准确识别AMPKα1或AMPKα2及其在化疗耐药性中的相应机制。

铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡（Liang等人，2022）。铁死亡的特征是细胞内游离亚铁离子（Fe²⁺水平升高和脂质过氧化物在细胞膜中的积累（Liang等人，2022）。先前的研究表明，化疗药物如多柔比星（DOX）主要通过细胞凋亡和铁死亡诱导癌细胞死亡（Shen等人，2024）。DOX通过干扰不稳定的铁池（LIP）和增加Fe²⁺水平来诱发铁死亡（Qiu等人，2024）。铁蛋白是主要的铁储存蛋白，它通过结合Fe²⁺来减少LIP从而防止铁死亡（Deng等人，2023）。铁蛋白的水平受铁蛋白自噬的调节，这是一种由核受体共激活因子4（NCOA4）介导的选择性自噬降解过程（Galy等人，2024）。铁蛋白自噬的激活会释放铁蛋白中的Fe²⁺，从而增加LIP，进而促进铁死亡。因此，阻断铁蛋白自噬或高水平的铁蛋白会使癌细胞产生化疗耐药性。实际上，在化疗耐药的癌症中，铁死亡途径通常被抑制，或者铁代谢受到干扰（Zhu等人，2023；Mao等人，2024；Song等人，2024）。然而，作为细胞代谢的关键调节因子，AMPK尤其是AMPKα2在化疗耐药癌症中的铁代谢和铁死亡抵抗中的作用仍不明确。

在本研究中，我们发现DOX耐药性TNBC中AMPKα2的表达水平升高。升高的AMPKα2在S151位点磷酸化NCOA4，导致NCOA4通过伴侣蛋白介导的自噬（CMA）降解，并随后导致FTH1的积累，从而在TNBC细胞中发生缺陷性的铁蛋白自噬。较高的FTH1水平会降低LIP并抑制DOX诱导的铁死亡。AMPKα2的缺失使DOX耐药的TNBC细胞重新对DOX治疗敏感，这表明靶向AMPKα2可能是管理TNBC化疗耐药性的治疗策略。

章节片段

临床组织收集

在宁波大学第一附属医院，经患者知情同意后收集了4个对DOX敏感的TNBC组织和4个对DOX耐药的TNBC组织样本。该研究方案已获得宁波大学第一附属医院伦理委员会的批准（KY20221201）。所有TNBC组织均立即冷冻并保存在液氮中直至使用。

细胞培养

MCF-10A正常乳腺上皮细胞以及包括MCF-7、T47D、MDA-MB-361、SKBR3、HCC1954在内的乳腺癌细胞系

升高的AMPKα2促进TNBC的DOX耐药性

为了研究AMPK催化亚基在乳腺癌中的作用，我们检测了四种不同分子亚型乳腺癌中的AMPKα水平。MCF-10A乳腺上皮细胞作为正常对照。如图1A-B所示，各种乳腺癌细胞亚型中的AMPKα水平均显著升高：管腔A型（MCF-7和T47D）、管腔B型（MDA-MB-361）、HER2阳性型（SKBR3和HCC1954）以及基底样型（也称为TNBC；MDA-MB-231和HCC1937）（图1A-B）。接下来，我们区分了这些亚型之间的差异表达

讨论

在本研究中，我们揭示了AMPKα2上调抑制TNBC中DOX诱导的铁死亡的机制。AMPKα2在S151位点磷酸化NCOA4，导致NCOA4通过CMA途径降解，随后FTH1水平升高和游离Fe²⁺水平降低，从而抑制DOX诱导的铁死亡（图9）。

AMPK作为重要的细胞能量传感器和调节器，负责调控能量和糖脂代谢、自噬以及线粒体功能（Trefts等

结论

总之，我们的研究表明，AMPKα2表达升高通过抑制铁死亡促进了TNBC细胞的DOX耐药性。AMPKα2在S151位点磷酸化NCOA4，通过CMA途径促进NCOA4降解，随后增加FTH1的水平，降低游离铁的水平，最终增强DOX耐药性。我们的发现为AMPKα2在TNBC中介导的DOX耐药性提供了新的见解，并提示靶向AMPKα2可能是一个有效策略

作者贡献声明

周淼：数据可视化、验证、数据管理。李林波：数据可视化、实验设计、方法学研究、数据分析。司子珍：初稿撰写、数据可视化、方法学研究、数据分析。刘新军：初稿撰写、数据可视化、方法学研究、数据管理。王希迪：审稿与编辑、项目监督、方法学研究、资金申请、概念构思。李基勇：审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了宁波市自然科学基金重点项目（2022J227）、浙江省医学与健康研究项目（2023RC261）、国家自然科学基金（82372610）、浙江省自然科学基金（LY23H160007）以及国家111项目（D16013）对XD.W的支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。