《Environment International》：Integrated network toxicology and molecular docking are used to elucidate the mechanism by which chlorpyrifos induces hepatotoxicity (
Cyprinus carpio)
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本研究针对广泛使用的有机磷农药毒死蜱（CPF）诱导肝毒性的机制不清问题，通过整合网络毒理学、分子对接和细胞实验，揭示了CPF通过稳定结合TP53蛋白，抑制SLC7A11/GPX4信号通路，扰乱铁稳态，诱发脂质过氧化和线粒体功能障碍，最终导致肝细胞铁死亡。研究发现，微量元素硒（Se）可通过GSH-GPX4轴有效缓解CPF的肝毒性，为环境污染物致肝损伤的干预提供了新靶点和理论依据。
在农业生产和家庭害虫防治中，有机磷农药毒死蜱（Chlorpyrifos, CPF）因其广谱高效的杀虫效果而被广泛使用。然而，这种农药的残留问题日益凸显，它可以通过食物链富集，最终在生物体内，尤其是在作为主要代谢和蓄积器官的肝脏中，达到相当高的浓度。已有研究表明，CPF暴露与肝功能损伤、免疫异常乃至神经毒性等多种副作用相关。肝脏是机体处理外源物质的核心场所，也因此极易受到此类环境毒物的攻击。尽管CPF的肝毒性已被观察到，但其具体的分子作用靶点和完整的毒性通路，特别是是否涉及近年来备受关注的一种铁依赖性的新型细胞死亡方式——铁死亡（Ferroptosis），仍有待深入阐明。同时，寻找有效且安全的干预策略以缓解CPF的毒性效应，对于保障生态环境安全和公众健康具有紧迫的现实意义。为了回答这些问题，来自东北农业大学的研究团队在《Environment International》上发表了一项研究，综合利用多种技术手段，深入探究了CPF诱导鲤（Cyprinus carpio）肝毒性的机制，并评估了微量元素硒（Selenium, Se）的潜在保护作用。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：首先，通过网络毒理学方法，从公共数据库筛选CPF相关靶点与肝损伤相关基因的交集，并进行蛋白互作（PPI）网络、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以预测核心靶点和关键通路。其次，采用分子对接和分子动力学（MD）模拟技术，验证CPF与核心蛋白（如TP53）的结合能力和稳定性。实验部分以原代培养的鲤肝细胞为模型（样本来源于实验动物），通过细胞活力（CCK-8法）检测确定CPF的半抑制浓度（IC50）和硒的干预浓度。随后，利用小干扰RNA（siRNA）技术敲低GPX4基因表达，以及使用GSH合成抑制剂BSO，在细胞水平上探讨GSH和GPX4在硒缓解CPF毒性中的作用。最后，通过一系列生化检测和分子生物学技术，包括铁离子含量测定、脂质过氧化产物（MDA, LPO）检测、谷胱甘肽（GSH）含量测定、线粒体膜电位（MMP）和活性氧（ROS）检测、实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blotting）等，系统评估了CPF对铁死亡相关指标和线粒体功能的影响。
3.1. 毒死蜱肝毒性潜在靶点的鉴定
通过整合GeneCards和NCBI数据库，研究人员获得了10949个肝损伤相关基因，并从毒理学数据库中获得1398个CPF相关基因。维恩图分析确定了1004个交集靶点。GO和KEGG富集分析表明，CPF肝毒性的潜在机制主要与氧化还原酶活性、脂肪酸代谢过程、谷胱甘肽代谢过程、对生物刺激的反应、铁死亡以及线粒体紊乱密切相关。KEGG通路分析进一步提示p53（TP53）信号通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路以及铁死亡等是CPF肝毒性的关键通路。蛋白互作网络分析确定了TP53、PTGS2、HIF1A等25个核心枢纽基因，提示它们在CPF诱导的肝细胞死亡中扮演重要角色。
3.2. 核心靶点蛋白的鉴定
为了从预测的枢纽基因中找出与CPF直接相互作用的关键蛋白，研究人员进行了分子对接分析。结果显示，在TP53、TNF、IL1β等9个核心蛋白中，TP53与CPF的结合能最低，表明两者结合最稳定。分子动力学模拟也证实了TP53-CPF复合物的稳定性。此外，人与鲤的TP53蛋白与CPF的结合位点相同，提示CPF对TP53信号通路的调控具有物种保守性。
3.3. 硒干预减轻毒死蜱诱导的铁积累和脂质过氧化
细胞实验发现，CPF处理会剂量依赖性地降低鲤肝细胞活力，其24小时IC50为35.21 μM。选择30 μM CPF进行后续实验，并发现硒（Na2SeO3）能剂量依赖性地缓解CPF引起的细胞毒性，1200 μM硒效果最佳。进一步检测发现，CPF显著增加了细胞内铁离子含量、脂质过氧化物MDA和LPO的水平，并降低了GSH含量，而硒干预能有效逆转这些变化。在分子水平上，CPF上调了TP53和ACSL4的表达，下调了SLC7A11、GPX4、FTH、NCOA4和FPN的表达，硒处理则能阻止这些基因表达的异常改变。
3.4. 硒缓解毒死蜱引起的线粒体功能障碍和ROS积累
线粒体是细胞的能量工厂，也是ROS的主要来源。研究发现，CPF处理导致线粒体膜电位下降、ATP含量减少、线粒体融合基因（Mfn1, Mfn2, Opa1）表达下调而分裂基因（Drp1, Fis1）表达上调，同时细胞内和线粒体内的ROS水平显著升高。硒的添加能够剂量依赖性地改善这些线粒体功能失调和氧化应激指标。
3.5. 硒抑制Erastin诱导的铁死亡和线粒体损伤
为了对比CPF与经典铁死亡诱导剂Erastin的毒性机制，并验证硒的广谱缓解作用，研究人员使用了Erastin。结果发现，Erastin同样能引起铁积累、GSH耗竭、脂质过氧化、线粒体功能障碍和ROS积累，且CPF与Erastin联合处理加剧了这些损伤。硒干预能够有效缓解Erastin和CPF单独或联合引起的有害效应，表明硒对铁死亡相关的肝损伤具有保护作用。
3.6. GSH通过减少脂质过氧化参与硒的保护作用
为了探究GSH在硒缓解CPF毒性中的作用，研究人员使用GSH合成抑制剂BSO耗竭细胞内的GSH。结果显示，BSO处理消除了硒对SLC7A11和NCOA4蛋白表达的调节作用，并逆转了硒对脂质过氧化和线粒体膜电位的保护效应，但对硒调节细胞内铁含量的作用影响不大。这表明硒主要通过GSH信号通路来缓解脂质过氧化和部分线粒体功能异常。
3.7. GPX4是硒抵抗毒死蜱肝毒性的关键节点
GPX4是含硒酶，是抵抗铁死亡的核心分子。研究发现，CPF降低了GPX4的蛋白水平（而非mRNA水平），而硒能剂量依赖性地恢复GPX4蛋白表达。通过siRNA技术敲低GPX4后，硒缓解CPF诱导的脂质过氧化作用被显著削弱，但硒对铁离子积累的调节作用未受影响。同时，GPX4敲低也影响了线粒体膜电位和融合/分裂相关基因的表达。这些结果说明，GPX4是硒发挥抗脂质过氧化作用的关键效应分子，而硒对铁稳态的调节可能不依赖于GPX4。
4. 讨论与结论
本研究通过整合生物信息学分析和实验验证，系统阐明了CPF诱导肝毒性的新机制。核心发现是CPF能够稳定结合并激活TP53，进而抑制其下游的SLC7A11表达，导致胱氨酸摄取受阻、GSH合成减少，最终使关键的抗氧化酶GPX4活性受抑。GPX4的失活导致其清除脂质过氧化物的能力下降，同时CPF还通过下调FTH、NCOA4和FPN扰乱铁代谢，引起铁超载，并上调ACSL4促进脂质过氧化，这些因素共同触发了肝细胞的铁死亡程序。线粒体作为此过程中的重要参与者，其功能紊乱加剧了氧化应激和能量危机。
本研究的重要亮点在于明确了微量元素硒的干预价值。硒通过促进GPX4蛋白的合成，增强了细胞抗氧化防御系统的能力。证据表明，硒的保护作用主要依赖于GSH-GPX4轴来对抗脂质过氧化，而对铁稳态的调节可能存在GPX4非依赖的途径。该研究不仅揭示了CPF肝毒性的关键靶点TP53/SLC7A11/GPX4信号轴，为环境污染物健康风险评估提供了新的生物标志物和机制见解，而且为利用营养干预策略（如补硒）预防或缓解农药残留相关的肝损伤提供了重要的理论依据和实验支持。未来研究可进一步探索CPF在多器官中毒性作用的共性机制以及硒在其他类型环境污染物毒性干预中的应用潜力。
