《Free Radical Biology and Medicine》：The novel Nrf2 agonist neobavaisoflavone attenuates periodontitis by inhibiting osteoclastogenesis through iron homeostasis regulation and senescence suppression
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骨代谢失衡是牙周炎和骨质疏松的核心机制，现有抗骨吸收药物存在长期安全性问题。本研究发现天然黄酮类化合物neobavaisoflavone（NBIF）通过抑制破骨细胞分化、调节铁代谢和KEAP1-NRF2信号通路，显著减少小鼠牙周炎模型中的骨吸收。其作用机制涉及降低细胞内铁浓度、抑制铁依赖性细胞死亡和衰老，为开发新型骨保护剂提供了理论依据。
廖一琳|陈静秋|赵瑶宇|姚汉涛|叶文婉月|唐惠琳|何振如|薛胜|卢少宗|胡有斌|姜莉莉|傅晓洲|闫琪|杜敏全|李婷|季耀婷
中国湖北省武汉市武汉大学口腔医学院及口腔医院，教育部口腔生物医学重点实验室，口腔颌面重建与再生国家重点实验室
摘要
背景
破骨细胞的过度活化是包括牙周炎在内的骨吸收性疾病的关键驱动因素。尽管目前的抗吸收药物在临床上有效，但其长期安全性和经济负担限制了其广泛使用，这突显了开发新型、基于机制的治疗策略的必要性。
目的
本研究旨在评估天然黄酮类化合物新木豆黄酮（NBIF）对破骨细胞功能及牙周炎进展的影响，并探讨其潜在的分子机制。
方法
在体外实验中，通过TRAP染色、F-actin环形成和扫描电子显微镜观察来评估破骨细胞的分化和吸收活性。机制研究采用了转录组分析、分子对接和细胞热位移测定（CETSA）技术。此外，还在结扎诱导的牙周炎小鼠模型中进一步评估了NBIF的治疗效果和安全性。
结果
NBIF显著抑制了体外破骨细胞的分化、F-actin环的形成和骨吸收。机制研究表明，NBIF直接结合Keap1，稳定Nrf2并促进其向核内的转运，从而上调铁转运蛋白FPN1的表达，降低细胞内铁水平，并抑制铁死亡信号通路和细胞衰老。在体内实验中，NBIF显著减轻了牙槽骨丢失，改善了小梁骨结构，并表现出良好的安全性。
结论
NBIF通过抑制KEAP1–NRF2–FPN1轴来抑制破骨细胞形成和骨吸收，显示出治疗骨吸收性疾病的强大潜力，强调了铁代谢–细胞衰老通路作为有前景的治疗靶点，并为与破骨细胞相关的骨丢失药物开发提供了新的方向。
引言
骨骼是一种高度动态的组织，其稳态依赖于形成与吸收之间的平衡[1]。当吸收超过形成时，这种平衡被打破，会导致牙周炎和骨质疏松等骨丢失疾病[2]。牙周炎是全球第六大常见疾病，其特征是牙槽骨的进行性破坏，给公共卫生和经济带来了重大挑战[3]。过多的破骨细胞数量和活性是牙槽骨破坏的主要因素[4]，因此需要阐明调控破骨细胞生成的分子机制并开发安全有效的疗法。
核因子红系2相关因子2（Nrf2）是一种对氧化应激敏感的转录因子，已知具有抗骨吸收作用[5]。在基础状态下，Nrf2通过与Keap1结合而滞留在细胞质中，随后通过Cullin3（Cul3）E3泛素连接酶复合物被蛋白酶体降解。在氧化应激条件下，Nrf2–Keap1相互作用被破坏，使Nrf2能够转移到细胞核内并诱导抗氧化和细胞保护基因的表达[6,7]。虽然我们之前的研究表明Nrf2激活可以抑制破骨细胞生成和骨吸收，但Nrf2调控破骨细胞分化的确切分子机制尚未完全阐明[8]。
铁死亡是一种独特的细胞死亡方式，其在机制和细胞形态上与凋亡、自噬、坏死和焦亡有根本区别[9]。其特征是铁依赖性的活性氧（ROS）积累和随后的脂质过氧化，最终导致细胞死亡[10]。最近，“铁死亡信号通路”的概念被提出，强调了其与肥胖和代谢性疾病之间的密切关联[11]。在破骨细胞生成过程中，细胞内铁水平显著升高，实验证据表明铁过载会促进破骨细胞分化[12]。这些发现表明，铁代谢可能通过铁死亡信号通路在破骨细胞生成中起调节作用，然而铁死亡信号通路是否直接调控破骨细胞分化以及是否可作为可行的治疗靶点仍不清楚。
目前的抗吸收药物（包括地诺单抗、双膦酸盐和雌激素替代疗法）虽然有效，但存在长期风险，如非典型骨折、颌骨坏死和激素相关癌症[13]，这凸显了寻找更安全、基于机制的替代方案的需求。黄酮类化合物是一类天然存在的植物化合物，具有抗炎、抗氧化和免疫调节作用，越来越被认为是保护骨骼的潜在药物[14]。其中，新木豆黄酮（NBIF）是一种天然存在的异黄酮，富含用于治疗骨质疏松和骨折的传统草药Psoralea corylifolia中，已被证实具有抗骨质疏松、抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性[15],[16],[17],[18]。然而，NBIF抑制破骨细胞生成的分子机制及其在牙周炎中的治疗潜力仍需进一步探索。
本研究旨在探讨NBIF抑制破骨细胞分化并减轻牙周炎相关骨丢失的潜在机制，特别关注铁死亡信号通路和细胞衰老在其作用中的作用。
试剂
新木豆黄酮（NBIF，CAS编号41060-15-5，纯度≥98%）购自成都德思特科技有限公司（中国成都），并溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。NBIF的化学结构如图1A所示。去铁胺（纯度≥98%，CAS编号70-51-9）购自Sigma-Aldrich（中国上海）。核因子κ-B配体激活剂（RANKL）购自Novoprotein（中国上海）。高糖DMEM、α-MEM和青霉素-链霉素也用于实验。
NBIF在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞分化
NBIF的化学结构如图1A所示。在RAW264.7细胞中，NBIF浓度≤8 μM时96小时后未表现出细胞毒性（图1B）。因此，在所有后续的功能实验中，NBIF以2、4和8 μM的非细胞毒性浓度使用，以确保细胞完整性。为了评估NBIF对破骨细胞生成的影响，RAW264.7细胞被RANKL（100 ng/mL）处理5天，并同时加入NBIF（2、4或8 μM）。TRAP染色结果显示...
讨论
骨骼稳态依赖于成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞驱动的骨吸收之间的精细平衡[38]。这种平衡的失调——尤其是破骨细胞的病理性过度活化——是包括牙周炎、骨质疏松和类风湿性关节炎在内的多种骨吸收性疾病的根本原因[39]。尽管目前的抗吸收疗法（包括双膦酸盐和地诺单抗）具有临床效果，但其长期使用受到安全性的限制。
作者贡献声明
廖一琳：撰写初稿、软件应用、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。陈静秋：审稿与编辑、验证、方法设计、数据分析、概念构建。赵瑶宇：方法设计、实验设计、数据管理。姚汉涛：方法设计、数据管理、概念构建。叶文婉月：方法设计、数据分析、概念构建。唐惠琳：方法设计、数据分析、概念构建。
数据可用性声明
与本研究相关的所有数据均已包含在文章中或作为补充信息上传。如需更多数据，可联系通讯作者获取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82372463、82172493，资助对象为季耀婷）的支持。
