《Fungal Biology》：Comparative analysis of mitochondrial genomes and evolutionary characteristics of five Alternaria species causing potato leaf spot diseases
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线粒体基因组比较分析揭示Alternaria物种的进化机制与结构多样性，发现核心基因保守而重复元件和间隔区差异导致基因组大小变化，正选择和假基因化提示适应性进化，系统发育分析支持单系群分类。
李艳亮|严峰|韩卓琳|张发英|傅爱华|高晓文轩|刘文文|杨巧梅|杨静|唐伟
中国云南省昆明市云南师范大学生命科学学院，邮编650500
摘要
线粒体在真菌的代谢、适应和致病性中起着核心作用，然而植物病原性链格孢属（Alternaria）物种的线粒体基因组（mitogenomes）的进化动态仍知之甚少。在这项研究中，我们对五种具有经济重要性的链格孢属物种——A. burnsii、A. tenuissima、A. arborescens、A. alternata和A. gossypina——进行了全面的比较线粒体基因组分析，以探讨其结构特征、基因组变异、选择压力、重复元件动态以及系统发育关系。这些线粒体基因组保留了13-14个核心基因、30-33个tRNA和2个rRNA，但由于内含子插入、基因间间隔序列和重复序列的差异而大小不一。所有物种都表现出强烈的A/U偏向密码子使用模式，这与高AT富集性和翻译优化一致。在关键呼吸复合体（cox1-3、atp6-9和cob）中，纯化选择占主导地位，表明存在功能限制；而阳性选择和假基因化的迹象（A. burnsii中的rps3破坏）则表明存在谱系特异性适应。我们在编码区和非编码区都发现了进化热点，这些区域富含插入缺失（indels）和重复扩展。共注释了920个简单序列重复（SSRs），其中A. burnsii的SSR密度最高，尤其是五核苷酸基序，这暗示了基因组可塑性的复制滑动现象。长重复元件与内含子移动和可能的重组事件有关，尤其是在A. arborescens中。对29种子囊菌（Ascomycota）物种的系统基因组分析证实了链格孢属在Pleosporales目中的单系进化关系，尽管属内的分辨率有限，但仍显示出复杂的进化历史。我们的发现支持“保守的核心与灵活的边缘”线粒体基因组进化模型，即线粒体创新有助于宿主适应和致病性。本研究强调了线粒体基因组作为真菌进化活跃驱动力的作用，并为探索真菌-宿主相互作用中的线粒体-宿主共同进化提供了基础。
引言
线粒体基因组是研究真核生物进化、系统发育和适应机制的关键分子标志物。在真菌中，线粒体基因组的大小和结构在不同物种间存在显著差异，通常范围在19至100千碱基对（kb）之间，这主要是由于内含子插入、基因复制以及水平转移序列的整合（Arcila-Galvis等人，2021年）。尽管基因组大小存在这种变异性，但其基因组成高度保守，通常包括11个呼吸链复合体亚基（cox1-3、cob、nad1-6、nad4L）、三个ATP合成酶基因（atp6、atp8、atp9）和两个rRNA基因（rns、rnl），以及参与氧化磷酸化和能量代谢的多态性tRNA基因簇（Paquin等人，1997年）。在线粒体基因组的进化过程中，表现出显著的结构多样性，包括基因组大小的变化、基因顺序的重组以及内含子和重复元件的插入（Bullerwell和Gray，2004年）。关于线粒体基因组与核基因组的进化速率的争论一直存在。历史上，人们普遍认为线粒体DNA在动物和某些真菌中的突变积累速度明显快于核DNA（Brown等人，1982年；Clark-Walker，1991年）。例如，在Rhynchosporium物种中，线粒体突变率估计是核基因组的77倍（Torriani等人，2014年）。然而，最近的比较分析提出了不同的观点，表明植物和真菌的线粒体基因组往往表现出较慢的分化速率（Sandor等人，2018年）。此外，进化动态可能随时间而变化；Christinaki等人（2022年）提出，在酵母的早期进化过程中，线粒体基因的进化速度比核基因慢，而在后期进化阶段这一趋势发生了逆转。总体而言，这些发现表明不同分类单元和时间段内的线粒体进化速率具有高度变异性。尽管存在这种变异性，线粒体基因组的独特特征——如基因重排和结构变异——对于物种鉴定、系统发育分析和理解致病机制仍然具有无可估量的价值（Aguileta等人，2014年）。
作为真菌界中最大且生态多样性最丰富的门类，子囊菌门在其三个主要亚门——Pezizomycotina（主要是丝状真菌）、Saccharomycotina（主要是酵母）和Taphrinomycotina（主要是裂殖酵母）之间表现出显著的线粒体基因组差异（Wolfe和Butler，2017年）。最近的研究表明，Pezizomycotina亚门的线粒体基因组（例如Penicillium expansum）通常具有较低的GC含量（24.8%）（Malik等人，2024年），而Saccharomycotina亚门的线粒体基因组则表现出基因组简化和AT偏向（Christinaki等人，2022年）。例如，Alternaria物种（A. tenuissima）的线粒体基因组GC含量为29.00%（Tan等人，2024年）。这些差异反映了不同亚门为应对环境压力而采取的不同进化策略。此外，线粒体基因组的这些特征使其成为研究真菌系统发育和进化的宝贵工具。例如，基于98个子囊菌线粒体基因的数据集进行的系统发育重建表明，线粒体基因组是有效的真菌系统发育标记（Ma等人，2022年）。这些研究不仅揭示了不同真菌群体中线粒体基因组的多样性和进化动态，还为理解真菌与其宿主植物之间的相互作用提供了新的见解。
链格孢属是子囊菌门中广泛分布的植物病原性和内生真菌属（DeMers，2022年）。该属物种的特点是具有隔膜的菌丝细胞、成链的深色分生孢子，分生孢子通常呈椭圆形或棒状，壁面光滑或有疣状突起，并在分生孢子顶端有截断延伸（Thomma，2003年；Woudenberg等人，2015年）。它们通过分泌宿主特异性毒素（HSTs）和降解细胞壁的酶（CWDEs），如果胶酶和纤维素酶，导致多种经济重要作物（包括马铃薯、番茄、苹果和柑橘）受损（Landschoot等人，2017年；Meena等人，2017年；Schmey等人，2024年；Wang等人，2022年）。然而，关于链格孢属物种线粒体基因组的研究仍然不足，只有少数物种的基因组序列完整，如A. alternata（50.1 kb，26个蛋白质编码基因）（Liao等人，2017年）和A. tenuissima（57.4 kb，12个编码基因，15个假想蛋白，34个tRNA，2个rRNA）（Tan等人，2024年）。线粒体基因组数据的缺乏严重限制了我们对能量代谢与致病性之间关系的理解，并阻碍了对该属真菌进化机制和致病适应性的深入研究。
随着高通量测序技术的发展，比较基因组学为阐明链格孢属物种的进化机制、致病适应性和宿主相互作用提供了新的视角（Dettman和Eggertson，2021年；Dettman和Gerdis，2024年）。尽管现有研究表明线粒体基因组在真菌分类、系统发育分析和功能研究中具有显著价值，但针对马铃薯病原性链格孢属物种的线粒体基因组特征及其与致病性关系的系统研究仍较为缺乏。
基于上述研究现状和已确定的科学问题，本研究旨在分析从云南省马铃薯叶片中收集的链格孢属分离株的线粒体基因组，以全面探讨其遗传结构、地理关系以及导致马铃薯叶斑病的遗传特征。具体而言，本研究将：（1）分析链格孢属分离株的线粒体基因组的基本特征，包括基因组成、基因排列和结构变异；（2）通过系统发育分析揭示五种物种（A. alternata YUN-Z0808、A. tenuissima YUN-Z0814、A. arborescens YUN-Z0872、A. burnsii YUN-Z1107和A. gossypina YUN-Z1108）之间的进化关系；（3）探讨线粒体基因组特征与马铃薯叶斑病致病机制之间的关系。这些研究将为精确控制马铃薯叶斑病提供理论基础，并为后续的功能研究和实际应用奠定基础，同时加深我们对链格孢属真菌线粒体基因组多样性和进化机制的理解。
样本收集、真菌分离和形态特征鉴定
2022年至2024年7月期间，从中国云南省昭通市、文山市、大理市和丽江市的田间共收集了100片Solanum tuberosum L. 4个地方品种的叶片。叶片被放置在无菌纸袋中，并在凉爽干燥的条件下运输到实验室进行立即处理。真菌分离采用组织片段培养法进行。简要来说，每个叶片样本首先用75%乙醇浸泡1分钟进行表面消毒，
五种链格孢属物种的分离和形态特征鉴定
对这五种分离株的形态特征鉴定显示，分生孢子的形态和菌落特征存在明显差异。五种链格孢属物种的形态特征如图1所示，并结合基因组测序数据，确定这些菌株的物种鉴定结果为：菌株YNU-Z0808为A. alternata，菌株YNU-Z0814为A. tenuissima，菌株YNU-Z0872为A. arborescens，菌株YNU-Z1107为A. burnsii，菌株
讨论
本研究从表现出叶斑症状的马铃薯叶片中分离出了五种链格孢属物种。分离频率分析显示，A. alternata和A. tenuissima是主要病原体，其分离频率分别高达98%和24%。相比之下，A. arborescens、A. burnsii和A. gossypina的分离频率分别为4%、2%和5%。这表明A. alternata和A. tenuissima是导致马铃薯叶斑病的主要病原体
结论
对五种链格孢属物种的比较线粒体基因组分析提供了有力证据，证明线粒体基因组的进化遵循“保守的核心与灵活的边缘”模型。虽然所有物种都保留了13-14个蛋白质编码基因、30-33个tRNA和两个rRNA基因这一核心结构，但这些基因组和结构的显著变异主要源于重复元件、内含子组成和基因间间隔序列的差异
作者贡献声明
张发英：撰写——审稿与编辑、资源整理、数据管理。傅爱华：撰写——审稿与编辑、软件使用、资源整理。严峰：撰写——审稿与编辑、软件使用、资源整理。韩卓琳：撰写——审稿与编辑、资源整理。杨巧梅：撰写——审稿与编辑、软件使用、资源整理。杨静：撰写——审稿与编辑、验证、监督。高晓文轩：撰写——审稿与编辑、可视化处理、验证、方法学设计。刘文文：撰写——审稿与编辑未引用参考文献
Hill等人，2023年；Walker和Moraes，2022年；Zhu等人，2025年；Ma等人，2022年；W等人，2020年。
数据可用性
五种链格孢属物种的线粒体基因组序列已发布在NCBI数据库中（PV822414.1、PV785815.1、PV785816.1、PV822416.1和PV822415.1），其他原始数据见手稿。RAW测序数据的项目编号为PRJCA051240。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
资助
本工作得到了云南省基础研究重点项目（202301AS070010）和云南省应用基础研究项目（202301AT070072）的支持。利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
