《Immunobiology》：ZBP1 aggravates acute lung injury in mice by promoting the macrophage inflammatory phenotype
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本研究旨在解决急性肺损伤(ALI)中巨噬细胞过度极化的调控机制问题。研究人员发现，miR-1298-5p通过靶向ZBP1，抑制NF-κB信号通路，从而改善线粒体功能障碍，最终抑制巨噬细胞M1极化，为ALI的治疗提供了新的潜在靶点。
论文解读
研究背景：急性肺损伤的“炎症风暴”与巨噬细胞的“双面性”
急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)是一种破坏性的呼吸系统疾病，以严重的低氧血症、肺泡水肿和炎症细胞浸润为特征，常常导致急性呼吸窘迫甚至死亡。在ALI的复杂发病机制中，巨噬细胞扮演着关键角色。巨噬细胞并非一成不变，它们可以根据微环境信号极化为不同的表型，其中M1型巨噬细胞是促炎的“破坏者”，能够分泌大量的促炎因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β），招募其他免疫细胞，从而加剧炎症反应和肺组织损伤。因此，深入阐明促炎巨噬细胞在ALI发病中的作用，对于开发新的治疗策略至关重要。
Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA-binding protein 1, ZBP1)是一种细胞质核酸传感器，在细胞死亡和炎症调控中发挥作用。已有研究表明，ZBP1在包括ALI在内的肺部疾病发展中扮演重要角色。例如，LPS（脂多糖）可以通过激活ZBP1介导的程序性坏死，促进巨噬细胞分泌促炎因子，从而诱导肺部炎症和损伤。然而，ZBP1在调控LPS诱导的巨噬细胞极化中的具体作用及其分子机制，仍有待进一步阐明。
线粒体作为细胞的“能量工厂”，其功能障碍在ALI的进展中扮演着重要角色。线粒体功能障碍会影响活性氧(ROS)的产生，并激活炎症信号通路，最终导致肺细胞凋亡。NF-κB信号通路是调控炎症的核心通路之一，它不仅能控制炎症因子和趋化因子的表达，还能调控线粒体功能。但线粒体功能障碍和NF-κB信号通路是否参与ZBP1调控的巨噬细胞极化，目前尚不清楚。
此外，微小RNA(microRNA, miRNA)作为内源性的非编码单链RNA，通过结合靶基因的3'非翻译区(3' UTR)来抑制基因表达，在ALI的调控中发挥着重要作用。生物信息学预测显示，ZBP1含有miR-1298-5p的结合位点，提示miR-1298-5p可能通过靶向ZBP1来调控其表达。然而，miR-1298-5p是否通过ZBP1调控巨噬细胞极化并影响ALI的进展，目前尚无报道。
基于以上分析，昆明医科大学附属昆明市儿童医院的研究团队开展了这项研究，旨在探索ZBP1在ALI中的作用及其通过调控巨噬细胞极化影响疾病进展的分子机制。
研究方法概览
为了回答上述科学问题，研究人员采用了多种实验技术，构建了体内和体外模型。在体内实验中，他们通过气管内滴注LPS建立了小鼠ALI模型，并利用慢病毒载体通过尾静脉注射敲低ZBP1的表达。在体外实验中，他们使用LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7，构建细胞损伤模型，并通过慢病毒转染或化学转染技术，分别对ZBP1和miR-1298-5p进行过表达或敲低操作。
研究团队运用了多种技术手段来评估肺损伤程度、细胞功能状态和分子机制。这些技术包括：苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子水平；蛋白质印迹(Western Blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测相关蛋白和基因的表达；流式细胞术检测细胞凋亡；免疫荧光染色观察蛋白定位；双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因的相互作用；以及通过MitoSOX染色、JC-1探针和ATP检测试剂盒评估线粒体功能。
研究结果
1. ZBP1在ALI中高表达且与巨噬细胞极化相关
研究人员首先发现，在ALI中ZBP1的表达水平显著升高。通过建立LPS诱导的ALI小鼠模型，他们观察到肺组织出现了明显的病理损伤，包括炎症细胞浸润、水肿、肺泡壁增厚和肺泡结构破坏。同时，ZBP1在肺组织中的蛋白和mRNA水平均显著上调。此外，促炎巨噬细胞标志物iNOS的表达增加，而抗炎巨噬细胞标志物Arg1的表达减少。相关性分析进一步证实，ZBP1的表达与iNOS呈正相关，与Arg1呈负相关。这些结果表明，ZBP1在ALI中高表达，并且与巨噬细胞的极化状态密切相关。
2. 敲低ZBP1可抑制LPS诱导的ALI
为了探究ZBP1表达对ALI的影响，研究人员在小鼠体内敲低了ZBP1。结果显示，ZBP1敲低显著改善了LPS诱导的肺组织病理损伤，降低了肺湿/干重比、支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白浓度以及肺组织中的髓过氧化物酶(MPO)活性。更重要的是，ZBP1敲低显著降低了肺组织中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。这些结果证实，敲低ZBP1能够有效抑制LPS诱导的ALI。
3. 敲低ZBP1可抑制LPS诱导的细胞损伤和线粒体功能障碍
在体外实验中，研究人员在RAW264.7细胞中敲低了ZBP1。他们发现，ZBP1敲低部分逆转了LPS诱导的细胞活力下降和细胞凋亡增加。在机制上，ZBP1敲低显著降低了LPS诱导的线粒体ROS水平升高，并逆转了线粒体膜电位的下降。同时，ZBP1敲低还增加了ATP含量和线粒体蛋白TOM20的表达。这些结果表明，ZBP1敲低能够抑制LPS诱导的细胞损伤和线粒体功能障碍。
4. ZBP1敲低通过NF-κB信号通路抑制巨噬细胞M1极化
研究人员发现，在ALI动物模型和细胞模型中，NF-κB信号通路的关键分子p-NF-κB p65/NF-κB p65的比值均显著上调。为了验证ZBP1是否通过NF-κB信号通路调控巨噬细胞极化，他们使用了NF-κB激活剂PMA。结果显示，ZBP1敲低显著降低了促炎巨噬细胞标志物（iNOS、CD80、CD86）的表达，并增加了抗炎巨噬细胞标志物（Arg1、CD163、CD206）的表达。然而，加入PMA后，ZBP1敲低对巨噬细胞极化的抑制作用被部分逆转。同样，ZBP1敲低对促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的抑制作用也被PMA所逆转。这些结果证实，ZBP1敲低通过抑制NF-κB信号通路来抑制巨噬细胞的M1极化。
5. miR-1298-5p在疾病中低表达并调控ZBP1表达
为了寻找ZBP1的上游调控分子，研究人员进行了生物信息学分析。他们发现，miR-1298-5p在ALI中表达水平显著降低，并且其与ZBP1的3' UTR存在互补结合位点。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-1298-5p能够直接靶向ZBP1并抑制其表达。在细胞实验中，过表达miR-1298-5p能够显著抑制ZBP1的蛋白表达水平。这些结果表明，miR-1298-5p是ZBP1的上游负调控因子。
6. miR-1298-5p通过ZBP1调控线粒体功能进而影响巨噬细胞M1极化
最后，研究人员探究了miR-1298-5p是否通过ZBP1调控线粒体功能和巨噬细胞极化。他们发现，过表达miR-1298-5p能够抑制巨噬细胞的M1极化，表现为促炎标志物表达下降、抗炎标志物表达上升，以及促炎因子分泌减少。同时，过表达miR-1298-5p还能改善线粒体功能，降低ROS水平，提高线粒体膜电位、ATP含量和TOM20表达。然而，当同时过表达ZBP1时，miR-1298-5p对巨噬细胞极化和线粒体功能的保护作用被逆转。这些结果最终证实，miR-1298-5p通过靶向ZBP1，抑制NF-κB信号通路介导的线粒体功能障碍，从而抑制巨噬细胞的M1极化。
结论与讨论
本研究首次揭示了miR-1298-5p/ZBP1/NF-κB信号轴在ALI发病机制中的重要作用。研究结果表明，在ALI中，miR-1298-5p表达下调，导致其对ZBP1的抑制作用减弱，ZBP1表达随之升高。高表达的ZBP1通过激活NF-κB信号通路，导致线粒体功能障碍，进而促进巨噬细胞向促炎的M1表型极化，最终加剧了肺组织的炎症损伤。
这项研究不仅阐明了ZBP1在ALI中调控巨噬细胞极化的新机制，还首次将miR-1298-5p定位为ZBP1的上游调控因子，并揭示了其在ALI中的保护作用。该研究为ALI的治疗提供了新的潜在靶点，即通过上调miR-1298-5p或抑制ZBP1的表达，来调控巨噬细胞的极化状态，从而缓解肺组织的炎症损伤。这为开发针对ALI的新型治疗策略提供了重要的理论依据和实验基础。
