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本文系统评估了26种化妆品常用表面活性剂对瞬时受体电位香草素亚型1（TRPV1）通道的激活作用。研究通过对比天然HaCaT细胞与稳定过表达TRPV1的工程细胞（hTRPV1-HaCaT）的Ca2+内流情况，揭示了传统阴离子表面活性剂（C12-C18）更易特异性激活TRPV1引发刺痛感，而氨基酸基表面活性剂和非离子表面活性剂则表现出更温和的特性，为婴幼儿及敏感肌护理产品的配方设计提供了关键数据支持。
引言
化妆品刺激被定义为由成分接触引起的可逆性炎症反应。在现实使用场景中，淋洗类产品中的表面活性剂可能同时接触皮肤和眼睛。历史上，表面活性剂引起的刺激性接触性皮炎（ICD）是最早被识别的职业性皮肤病之一，常见于经常接触清洁剂的家庭工作者和医务人员等职业群体。先前的研究证实，清洁产品能够渗透到角质层（SC）上层并使蛋白质变性，即使在极短的时间内也可能导致SC脂质的去除和破坏。表面活性剂破坏角质层的脂质结构，诱导蛋白质变性并渗透到角质形成细胞层，这一过程可能引发炎症介质的释放，最终导致红斑、脱屑、干燥和弹性丧失等临床表现。
在表面活性剂与眼刺激的关系方面，脂质组学分析表明，常见的刺激物如苯扎氯铵、十二烷基硫酸钠和曲拉通X-100会显著破坏人角膜上皮细胞的脂质稳态，表现为神经酰胺增加、含多不饱和脂肪酸的磷脂减少以及磷脂酶A2的激活，这表明脂质代谢紊乱介导了炎症和细胞死亡过程。此外，角膜是人体神经分布最密集的组织之一，富含感觉神经和自主神经纤维，因此对刺痛感特别敏感。
尽管动物实验在化妆品行业中的应用趋势是使用替代性的体外测试来评估成分和最终产品的安全性和有效性，例如牛角膜混浊和通透性测试（OECD TG 437）、短期暴露体外测试（OECD TG 491）、重建人角膜样上皮测试（OECD TG 492）和荧光素渗漏测试（OECD TG 460），但这些测试的终点主要集中在化学物质的毒性和刺激性上，很少研究其他通路，例如由伤害感受器激活引起的刺痛感。
TRP家族在2021年获得诺贝尔生理学或医学奖后引起了广泛关注。它是一类离子通道蛋白，大多数对Ca2+具有通透性。TRPV和TRPM亚群都存在于皮肤感觉神经纤维上，可以被不同的温度激活。其中，TRPV家族中最著名的明星成员——瞬时受体电位香草素亚型1（TRPV1），是一种非选择性、热敏性离子通道，作为有害刺激的检测器发挥作用。当受体被激活时，感觉纤维中的离子内流会导致灼痛或灼痒。从辣椒中提取的辣椒素是TRPV1的特征性激动剂。研究表明，角膜神经元的TRPV1在愈合和伤害性传导中起着重要作用。此外，有研究显示，损伤后TRPV1阳性神经占据了角膜神经的更高比例。Lilja及其团队使用转染的SH-SY5Y细胞（组成性高表达TRPV1受体）来研究表面活性剂诱导的TRPV1活性。同样，Forsby及其同事使用表达TRPV1的SH-SY5Y细胞来评估婴儿洗发水的眼刺痛潜力。此外，中国国家市场监督管理总局（CSAMR）和中国国家标准化管理委员会（CSA）于2023年联合发布了国家标准《化学品 急性眼刺激体外细胞试验 TRPV1活性检测方法》（GB/T 43450-2023），旨在从政府层面为化妆品行业建立一种离体眼安全性方法。因此，可以假设TRPV1的激活可以作为化妆品安全性评价的指标之一。
然而，历史数据很少同时包含天然细胞和稳定过表达TRPV1的工程细胞（下文称为hTRPV1细胞）的Ca2+内流情况。因此，这些结果在消除非特异性激活方面可能存在局限性。为了同时涵盖眼刺激和皮肤刺激反应，本研究使用两种类型的永生化人角质形成细胞系——天然HaCaT细胞和工程化hTRPV1-HaCaT细胞，来寻找表面活性剂的刺激性与TRPV1通道之间的关系。
材料与方法
细胞
人永生化角质形成细胞系HaCaT（购自中国典型培养物保藏中心）通过使用含有人TRPV1基因的质粒进行稳定转染。转染程序由第三方公司（Genscript USA Inc.）进行，并附有分析证书。使用1 μg/mL嘌呤霉素在细胞池中选择hTRPV1-HaCaT细胞。因此，为了纯化过表达细胞，hTRPV1-HaCaT细胞作为单层维持在10 cm培养皿中，使用DMEM、10%胎牛血清（FBS）和1 μg/mL嘌呤霉素。天然人永生化角质形成细胞系HaCaT购自中国典型培养物保藏中心，并在10 cm培养皿中维持，使用DMEM和10% FBS。培养基每2天更换一次，细胞在37°C、5% CO2条件下培养。
测试产品
本测试选择了市场上现有的26种表面活性剂。所有表面活性剂均为当今化妆品行业常用，并分为四组：阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和天然植物提取物。
Western Blot
用PBS缓冲液冲洗后，向hTRPV1-HaCaT细胞和天然HaCaT细胞的每个10 cm培养皿中加入1 mL RIPA裂解缓冲液，确保整个提取过程在冰上进行。将解离的细胞收集到1.5 mL离心管中，在12,000 rpm离心5分钟后，通过BCA蛋白测定试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度。将样品上样缓冲液中的蛋白质（18 μg）在10% Tris-Glycine凝胶上进行分离。使用硝酸纤维素膜进行蛋白质转移。用快速封闭缓冲液进行非特异性免疫印迹30分钟后，将TRPV1蛋白与1:1000抗TRPV1抗体在封闭缓冲液中于4°C过夜结合。随后用TBST缓冲液（TBS缓冲液中含有0.001% Tween 20）冲洗3次，使用1:5000 HRP偶联抗兔IgG抗体在室温下进行二次结合45分钟。使用化学发光图像分析系统进行可视化。
Ca2+内流测定
通过天然HaCaT细胞和hTRPV1-HaCaT细胞测试了26种表面活性剂。辣椒素作为阳性对照，辣椒平是特异性TRPV1受体拮抗剂。为了确定每种表面活性剂引起的Ca2+内流的特异性，将辣椒平加入到六个样品孔中的三个孔中进行预孵育。在后续步骤中分析样品孔和含辣椒平的样品孔之间的显著差异。在测量前一天以20,000至40,000个细胞/孔的密度接种细胞。当每个孔达到90%汇合度时，使用FLIPR Calcium 6测定试剂盒进行Ca2+内流测定。所有孔在37°C下用加载缓冲液孵育2小时后，向辣椒素（+）和样品（+）孔中加入100 μM辣椒平孵育5分钟，以特异性结合TRPV1受体。同时，空白对照孔和样品孔则加入稀释缓冲液。根据初步实验结果，将表面活性剂用HBSS进行2倍梯度稀释，共6个浓度，最高浓度为活性物含量的0.01%（重量/体积），以避免细胞毒性。然后，在激发波长485 nm、发射波长525 nm下，使用Flexstation 3仪器测试1 μM辣椒素和稀释样品。记录基线30秒后，记录Ca2+内流信号2分钟，间隔1.54秒。所有实验均进行三次重复。
统计分析
使用GraphPad Prism 10.3计算浓度-效应曲线。只要每种细胞类型每个浓度的最高Ca2+内流超过辣椒素的20%，就使用双向方差分析（ANOVA）检验来统计分析不同条件之间的统计学显著差异，即特定表面活性剂在相同浓度下对hTRPV1-HaCaT细胞（无辣椒平）与天然HaCaT细胞（无辣椒平）的激活效应，以及hTRPV1-HaCaT细胞（无辣椒平）与hTRPV1-HaCaT细胞（有辣椒平）的激活效应。实验中使用对数剂量-反应（四参数）模型。
结果
HaCaT细胞上TRPV1过表达的验证
Western Blot
结果显示，hTRPV1-HaCaT细胞在特定的95-kDa条带处显示出强烈的TRPV1蛋白阳性信号，而天然HaCaT细胞不表达。此外，在hTRPV1-HaCaT细胞和天然HaCaT细胞中均观察到70-80 kDa条带，这与Lilja工作中的结果相对应。
辣椒素的Ca2+内流测定
通过天然HaCaT细胞和hTRPV1-HaCaT细胞进行的辣椒素测试结果表明，尽管天然HaCaT细胞有TRPV1蛋白表达，但当辣椒素浓度为1 μM时，只有hTRPV1-HaCaT细胞能触发特异性Ca2+内流，而天然HaCaT细胞则不能。结果显示，1 μM辣椒素能够激活TRPV1通道，而TRPV1拮抗剂100 μM辣椒平能够特异性抑制辣椒素的作用。相比之下，辣椒素和辣椒平不能影响天然HaCaT细胞测试中的Ca2+内流。
26种表面活性剂在hTRPV1-HaCaT细胞和天然HaCaT细胞上引起的Ca2+内流
参考GB/T 43450-2023，当Ca2+内流等于或超过辣椒素的20%时，认为被测化合物具有潜在的刺痛风险。结果显示，只有13种表面活性剂在所有六个浓度下对hTRPV1-HaCaT细胞和天然HaCaT细胞均无引起Ca2+内流的能力。其余13种表面活性剂的结果各不相同。首先比较了两种细胞上Ca2+的激活结果，显示10种被测表面活性剂（包括琥珀酸二钠月桂醇聚醚酯、甲基椰油酰基牛磺酸钠、羟丙基磺酸钠月桂基葡糖苷交联聚合物、椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂基葡糖苷羧酸钠和月桂基葡糖苷、月桂醇聚醚硫酸酯钠、C14-16烯烃磺酸钠和月桂基羟基磺基甜菜碱）在hTRPV1-HaCaT细胞上的Ca2+内流激活可能高于天然HaCaT细胞，在大多数测试浓度下p ≤ 0.05。相比之下，其余3种表面活性剂似乎在几乎所有浓度下在天然HaCaT细胞上触发的Ca2+内流都高于hTRPV1-HaCaT细胞。假设图中的表面活性剂在两种细胞类型中触发了非特异性Ca2+内流。
此外，为了验证图中10种表面活性剂引起的Ca2+内流的特异性，还在hTRPV1-HaCaT细胞上进行了有辣椒平和无辣椒平测试之间的双向方差分析。琥珀酸二钠月桂醇聚醚酯、月桂醇聚醚硫酸酯钠、C14-16烯烃磺酸钠、甲基椰油酰基牛磺酸钠和椰油酰胺丙基甜菜碱能够在超过三个浓度下激活TRPV1通道，并被TRPV1拮抗剂辣椒平特异性阻断。椰油酰胺丙基甜菜碱和天然植物提取物在最高的一两个浓度下触发了Ca2+内流，辣椒平可以在一定程度上抑制这种内流。相反，其余三种（羟丙基磺酸钠月桂基葡糖苷交联聚合物、月桂基葡糖苷羧酸钠和月桂基葡糖苷、月桂基羟基磺基甜菜碱）可能具有非特异性兴奋作用。
讨论
为了探索被测表面活性剂与hTRPV1 HaCaT Ca2+内流测定之间的联系，将26种表面活性剂分为四类：阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂和天然植物提取物。每种表面活性剂引起特异性Ca2+内流的浓度也已列出。结果显示，具有较小抗衡离子（本实验中为铵离子）的阴离子表面活性剂似乎具有细胞毒性，并导致非特异性Ca2+内流。相反，基于氨基酸的阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂比其他类别更不可能在hTRPV1-HaCaT细胞和天然HaCaT细胞上触发Ca2+内流。考虑到其特性，两性离子表面活性剂和植物提取表面活性剂的结果各不相同。
表面活性剂对皮肤的渗透性与化学结构有关，特别是扩展的头基结构。阴离子表面活性剂是一类历史非常悠久的产品，具有最长的表面活性剂类别。根据其亲水基团的结构，可分为羧酸盐或硫酸酯衍生物两大类。根据表面活性剂1至4的结构特征，结果明显表明，具有较高碳氢链R（C12至C18之间）的传统阴离子表面活性剂（本研究中测试的琥珀酸二钠月桂醇聚醚酯、甲基椰油酰基牛磺酸钠、月桂醇聚醚硫酸酯钠和C14-16烯烃磺酸钠）更容易激活特异性Ca2+内流。这可能源于它们高密度的-SO3–或-OSO3–头基，这些头基充当“质子模拟物”。它们的阴离子头基在受体位点产生局部酸性微环境或通过调节表面电位直接改变电荷分布，从而使对质子敏感的TRPV1通道敏感化并激活。此外，头基静电对接在TRPV1通道富含Arg的E环上，而它们柔性的疏水尾部则深深插入外叶。这可能会产生足够的曲率应力，以稳定与辣椒素相同的开放构象，从而引起特异性Ca2+内流。有趣的是，脂肪族香草醛化合物被发现是有效的TRPV1激动剂，并能引发疼痛反应。此外，研究表明，市场上一些主要含有月桂醇聚醚硫酸铵、月桂醇聚醚硫酸钠或月桂醇硫酸铵作为表面活性剂的淋洗类个人护理产品，在人体眼刺激测试中也表现出最强的刺痛感，这与本研究的结果相符。尽管月桂醇聚醚硫酸铵和月桂醇硫酸铵被归类为阴离子表面活性剂，但其潜在的高细胞毒性可归因于多种因素的组合。首先，铵抗衡离子的较小水合半径与表面活性剂头基形成更紧密的离子对，导致静电排斥力降低，促进更紧密的堆积和更有效地插入脂质双层。其次，它们的高界面活性使其能够快速吸附在细胞膜上，疏水的月桂基链穿透双层的核心，而阴离子头基破坏脂质-蛋白质相互作用。这种效应损害了膜的完整性，导致孔的形成和最终的细胞裂解。最后，这两种表面活性剂可以结合并使膜和细胞内蛋白质变性，进一步加剧细胞损伤。
与传统阴离子表面活性剂不同，氨基酸基表面活性剂是一类以氨基酸残基作为极性头基的表面活性剂，由于其与皮肤的良好相容性，近年来获得了极大的普及。氨基酸基表面活性剂，如椰油酰甘氨酸钾、椰油酰甘氨酸钠和椰油酰谷氨酸二钠，被认为是当今温和的表面活性剂，结果证明这类表面活性剂不会通过TPRV1通道引起Ca2+内流。本研究的结果与一般客户反馈和先前的研究有一定的一致性。一项涉及105名受试者的研究表明，氨基酸阴离子表面活性剂不会引起任何过敏或刺激反应，并且比大多数市售成分具有更好的耐受性。体外实验也证实，基于赖氨酸的表面活性剂诱导角质形成细胞释放促炎因子IL-1α的能力远低于SLS，表明其皮肤刺激潜力极低。
两性离子表面活性剂是在同一分子中同时含有阴离子和阳离子亲水基团的表面活性剂，最大的特点是既能给出质子又能接受质子。Morris及其团队证实，阴离子表面活性剂的短期渗透可能基于单体浓度，而长期渗透可能基于表面活性剂对皮肤屏障的损伤。由于两性离子表面活性剂同时具有阳离子和阴离子表面活性剂的特性，因此也分析了表面活性剂溶液的pH值。椰油酰胺丙基甜菜碱和椰油酰胺丙基甜菜碱，分别具有铵阳离子和复杂的多头极性基团，无论pH是酸性还是碱性，都充当TRPV1离子通道的特异性激动剂。相比之下，月桂基羟基磺基甜菜碱，以其强水合磺酸基团和刚性离子对为特征，充当膜破坏者，通过物理化学破坏脂质双层的完整性引起非特异性钙内流。
与离子型表面活性剂不同，非离子表面活性剂是一组在水中不电离成离子状态的两亲性化合物。非离子表面活性剂具有高表面活性、水溶液低表面张力、低临界胶束浓度和大胶束聚集数的特点。它们具有很强的溶解性，并且擅长乳化和去污。非离子表面活性剂的疏水原料是具有活性氢原子的疏水化合物，如高碳脂肪醇、脂肪酸、高碳脂肪胺、脂肪酰胺等物质。这可能是本研究中列出的大多数非离子表面活性剂倾向于被归类为非TRPV1激动剂化合物的原因。
近年来，随着对环保、可生物降解的天然产品需求的增加，天然成分在化妆品行业引起了极大关注。在过去，特别是在化学合成洗涤剂普及之前，无患子果实因其天然皂苷成分而是一种常见的天然洗涤剂。它是一种特殊的天然表面活性剂，具有优异的清洁、乳化和润湿性能。此外，它还具有快速生物降解性和环境友好性等显著优势，并且被认为对皮肤温和无刺激。然而，在本研究中，它在最高两个浓度下被认为是潜在的TRPV1激动剂，具有特异性Ca2+内流，未来应研究更多的植物提取表面活性剂。
结论
总之，本研究试图验证不同种类表面活性剂与TRPV1通道之间的关系，希望为验证体外TRPV1评估方法在眼刺痛评价中的价值提供额外数据。此外，具有较小抗衡离子（例如铵离子）的阴离子表面活性剂似乎具有细胞毒性，可能导致非特异性Ca2+内流。具有较高碳氢链R（C12至C18之间）的传统阴离子表面活性剂由于多方面原因更容易激活特异性Ca2+内流。两性离子表面活性剂引起的刺痛效应更可能与分子结构有关，而不是pH值。在TRPV1通道激活方面，基于氨基酸的表面活性剂和非离子表面活性剂似乎更温和；这些发现可能有益于婴幼儿护理清洁产品的配方设计。未来，还应评估与TRPV1通道相关的更多测试，例如下游细胞因子。
