温控杂化水凝胶：用于基础培养基中锌离子的可逆与选择性去除

《ACS Omega》：Temperature-Controlled Hybrid Hydrogels for Reversible and Selective Zinc(II) Removal from Minimal Culture Media

本文开发了一种基于Zap1蛋白锌结合结构域（Zap1zf12）与聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）的温控杂化水凝胶（PNIPAM-co-Zap1zf12）。该材料通过温度变化（37°C捕获，25°C释放）实现Zn2+的可逆吸附与再生，无需竞争性螯合剂。在基础培养基中，该水凝胶对Zn2+的去除效率高达98.4%，且对Mg2+、Ca2+、Fe3+等必需金属离子干扰极小，为构建锌缺乏（Zn2+-deficient）研究体系提供了高效、便捷的新工具。

　　

1. 引言

锌离子（Zn²⁺）是生物体必需的微量元素，在多种生理过程中扮演关键角色。为了研究锌依赖的生物学过程，构建锌缺乏（Zn²⁺-deficient）体系是常用的策略。然而，实验室环境和试剂中普遍存在的锌离子会引入过量的背景锌，使得建立锌缺乏条件变得困难，并降低了实验的一致性和可重复性。

目前，用于去除Zn²⁺的策略主要包括小分子螯合剂和聚合物材料。小分子螯合剂如EDTA和TPEN虽然对Zn²⁺具有高亲和力，但形成的Zn²⁺-螯合剂复合物难以从溶液中去除，会引入额外的实验复杂性。相比之下，聚合物材料如Chelex 100树脂提供了更实用的方法，能够通过物理方式将Zn²⁺与固体支持物一同移除。然而，Chelex 100会非特异性地去除其他必需离子，因此需要在处理前后对金属浓度进行量化以确保正确恢复。

锌结合蛋白通常具有高亲和力和选择性，为传统的聚合物支持螯合材料提供了有前景的功能补充。例如，利用人S100A12蛋白开发的A12-树脂，能够从复杂的生物溶液中有效去除Zn²⁺，证实了蛋白质基材料在选择性Zn²⁺去除方面的潜力。

选择合适的聚合物基质对于蛋白质基材料至关重要，它不仅提供结构支持，还能引入额外的功能。在各种候选材料中，水凝胶能够响应多种外部刺激发生可逆变形，并广泛应用于治疗递送、组织修复等领域。聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）水凝胶是一种温敏水凝胶，在其低临界溶解温度（LCST）附近会发生体积转变。基于这一特性，结合PNIPAM与金属结合肽或蛋白质的杂化PNIPAM水凝胶系统已被开发用于温度调控的金属离子富集。例如，通过将镉结合肽CadRpep和铅结合肽PbrRpep整合到PNIPAM网络中，实现了Cd²⁺和Pb²⁺的选择性富集。此外，SUP蛋白的固定化将这些系统从基于肽的应用扩展到基于蛋白质的应用，并实现了铀的吸附。这些应用突显了该平台在开发温控可逆Zn²⁺吸附方面的潜力。

在杂化PNIPAM水凝胶系统中，还需要一个合适的蛋白质组分来实现Zn²⁺特异性和可控的吸附。Zap1是一种锌响应转录调控蛋白，介导酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的Zn²⁺摄取和液泡转运。Zap1中的Zf1-Zf2激活域（本文称为Zap1zf12）包含两个锌指基序，因其高亲和力和选择性而被广泛应用于Zn²⁺传感器。其优异的结合特性和相对简单的结构使其非常适合整合到PNIPAM杂化系统中。Zap1zf12具有两个结合位点，这增强了杂化系统的Zn²⁺吸附效率，并将其扩展到支持双位点蛋白质整合。值得注意的是，有必要在Zap1zf12内合理设计交联位点。这样的设计有助于PNIPAM诱导的Zap1zf12有效构象转换，这是实现温度控制Zn²⁺捕获和释放的基础。

本研究开发了一种新型蛋白质基吸附材料（PNIPAM-co-Zap1zf12），通过将Zap1zf12的高Zn²⁺选择性与PNIPAM的温敏行为相结合，用于选择性去除Zn²⁺。构建策略侧重于优化Zap1zf12中的交联位点设计、蛋白质修饰过程和水凝胶聚合程序。该水凝胶通过温度诱导的收缩和溶胀，能够在37°C捕获Zn²⁺并在25°C释放，从而无需使用竞争剂即可实现再生。它在Zn²⁺溶液中实现了98.4 ± 7.3%的去除效率，并能从各种基础培养基中选择性去除Zn²⁺，而不会显著干扰Mg²⁺、Ca²⁺和Fe³⁺等其他金属离子。因此，该材料扩展了杂化PNIPAM水凝胶的多功能性，使其能够选择性吸附Zn²⁺并整合具有双结合位点的蛋白质。此外，它还有望作为构建Zn²⁺缺乏培养环境的实用工具。

2. 材料与方法

2.1. 细菌菌株、化学试剂和培养基

所有质粒构建均在大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α中进行，而表达测定则在E. coli BL21 (DE3)中进行。细菌在Luria-Bertani (LB)肉汤中培养。

Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺的标准溶液购自中国计量科学研究院。N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS）购自毕得医药，其中NIPAM使用2:3（v/v）的己烷/甲基苯混合物重结晶三次。Chelex 100树脂购自Sigma-Aldrich。

2.2. 构建、表达和纯化

表达质粒pET30a-12His-ELP-Zap1zf12的结构如图S1所示。编码12His-ELP-Zap1zf12及其突变体的基因经过密码子优化并由金斯瑞合成，然后克隆到EcoRI和HindIII位点之间的表达质粒中。

表达菌株在37°C培养过夜，然后以1:100的比例稀释到1 L LB培养基中。当OD₆₀₀达到0.5时，用0.05 mmol/L IPTG在25°C诱导表达8小时。

将1 L培养物的细胞重悬于25 mL裂解液中，超声裂解20分钟。裂解液离心后通过0.45 μm膜过滤，上清液上样至HisTrap Ni-NTA HP柱。用18%缓冲液B平衡后，用50%缓冲液B洗脱目标蛋白。洗脱的组分随后浓缩并在缓冲液C中进行缓冲液置换，用于HRV3C蛋白酶切割融合标签。消化2小时后，样品上样至HisTrap Ni-NTA HP柱，用缓冲液A洗涤。用15%缓冲液B洗脱标签切割后的Zap1zf12蛋白，浓缩，最后通过凝胶过滤在预平衡的HiLoad 26/60 Superdex 200柱上进行纯化。

2.3. 使用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS）修饰Zap1zf12

使用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS）将丙烯酰基引入蛋白质N末端的α-NH₂基团和赖氨酸残基的ε-NH₂基团。纯化的Zap1zf12及其突变体在修饰前预先与Zn²⁺结合以保护金属结合位点，然后进行缓冲液置换至修饰缓冲液中。将溶解在DMSO中的NAS以相对于修饰位点数量1:1的摩尔比添加到蛋白质溶液中。反应在25°C下进行5分钟，然后通过加入过量的Tris-HCl（pH = 8.0）淬灭。修饰后的蛋白质进行脱盐并通过MALDI-TOF-MS分析。

2.4. 杂化水凝胶的合成

将修饰后的蛋白质置换到合成缓冲液中，准备用于水凝胶合成。杂化水凝胶通过自由基聚合合成。将220 mg NAS溶解在1.7 mL ddH₂O中，加入25 mL三颈圆底烧瓶，然后加入100 μL N,N-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）（22 mg/mL）和100 μL Na₂SO₃（10 mg/mL）。混合物在20°C下轻轻搅拌10分钟，同时通氮气。通过加入100 μL K₂S₂O₈（40 mg/mL）引发聚合。1分钟后，将1 mL修饰蛋白（0.7 mg/mL）引入反应中。在连续氮气流下，杂化水凝胶在大约20分钟内形成。将所得水凝胶转移至50 mL离心管中，在洗涤缓冲液中经历至少五个溶胀-收缩循环，以去除未结合的蛋白质和残留反应物。

每个溶胀-收缩循环包括在25°C溶胀6小时直至完全溶胀，然后在37°C孵育6小时直至完全收缩。

2.5. 杂化水凝胶的表征

使用GenScript SurePAGE Bistris Gels（4–12%）和MOPS SDS运行缓冲液，在180 V电压下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白质样品。使用Mettler DSC823e差示扫描量热仪（DSC）在氮气氛下测定含有不同蛋白质量（0、0.1、0.5和1.0 mg/mL）的杂化水凝胶的LCST。扫描在29至41°C范围内以2.0°C/min的加热速率进行。使用Hitachi S-4800扫描电子显微镜在10.0 kV加速电压下表征冻干水凝胶的结构。溶胀比计算为水凝胶在溶胀状态下的质量与收缩状态下质量的比值。

2.6. 杂化水凝胶金属富集性能表征

杂化水凝胶的Zn²⁺捕获和释放性能评估如下。在20 mL 10 μmol/L Zn²⁺溶液中经历一个完整的溶胀-收缩循环（在25°C溶胀6小时直至完全溶胀，然后在37°C孵育6小时直至完全收缩）后，将水凝胶等分为两部分。一部分用于评估Zn²⁺捕获能力，另一部分用于评估在洗涤缓冲液中经历五个额外溶胀-收缩循环后的释放性能。两部分水凝胶在用HNO₃酸化后，通过ICP-MS测量Zn²⁺浓度。不含蛋白质的水凝胶作为阴性对照平行处理。

通过将杂化水凝胶在含有Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺（各10 μmol/L，总体积20 mL）的混合离子溶液中经历一个溶胀-收缩循环来评估其金属离子选择性。接下来，将收缩的水凝胶在37°C的洗涤缓冲液中浸泡30分钟，重复此步骤五次。最后，将洗涤后的水凝胶酸化，并通过ICP-MS分析金属含量。每种金属离子的分配系数（K_d）计算如下：

K_d= [(C_i- C_e) × V] / (C_e× m)

其中C_i和C_e分别代表溶液中金属离子的初始浓度和平衡浓度（μmol/L）；V是溶液体积（mL）；m是吸附剂质量（g）。使用完全溶胀的水凝胶质量计算分配系数。

为了检查Zn²⁺捕获-释放的可循环性，水凝胶在Zn²⁺溶液（10 μmol/L，20 mL）中经历一个溶胀-收缩循环，然后进行五个洗涤循环。此过程重复五次，每次重复后通过ICP-MS测量溶液中的残留Zn²⁺浓度。

在几种培养基中评估了杂化水凝胶的选择性Zn²⁺去除性能。将水凝胶在25°C下浸入20 mL每种培养基中12小时，然后在37°C下收缩5小时。同时，将1.0 g Chelex 100树脂在25°C下与20 mL每种培养基孵育12小时。对于两种处理，在孵育前后通过0.22 μm膜过滤培养基并通过ICP-MS进行分析。

所有实验数据的误差值代表三个独立平行实验的平均值±标准偏差（SD），组合标准偏差使用不确定度传播方法估算。对于以百分比表示的数据，超过100%的轻微超出是由于计算中的统计变异，不代表物理上有意义的值。所有数据在物理上限制在[0–100%]范围内。

2.7. 定量实时PCR（qPCR）

使用定量实时PCR（qPCR）分析酿酒酵母（S. cerevisiae）中ZRT1、ZRT2和ZRT3基因的转录水平。在酵母氮基培养基和水凝胶处理的酵母氮基培养基中过夜培养后，收获酿酒酵母细胞用于总RNA提取。使用Sangon Bacterial Total RNA Rapid Extraction Kit按照制造商的说明分离总RNA。使用iScript cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad）对100 ng RNA进行逆转录反应。所得cDNA用于qPCR，使用SsoFast EvaGreen Supermix（Bio-Rad）。引物序列如下：对照基因ACT1，ACT1-F（5′-CCAGAAGCTTTGTTCCATCC-3′）和ACT1-R（5′-ACGGACATCGACATCACACT-3′）；ZRT1，ZRT1-F（5′-CCACTTAATGGACCCTGCTT-3′）和ZRT1-R（5′-ATGGCAGGACACCATGAATA-3′）；ZRT2，ZRT2-F（5′-TCGAGGAGGAAGATAAAGAGCA-3′）和ZRT2-R（5′-CAGATAGCGAAAGACCCACAA-3′）；ZRT3，ZRT3-F（5′-TGAGCGTTACTGCAGGGTTC-3′）和ZRT3-R（5′-GTGCCTGAGCTATGGGACTG-3′）。使用比较C_T（2^–ΔΔC_T）方法定量mRNA表达水平。

3. 结果与讨论

3.1. Zap1zf12交联位点的设计

为了构建适用的杂化水凝胶，Zap1zf12蛋白被用作功能模块，并通过交联位点固定在水凝胶基质内。当温度在25°C和37°C之间变化时，水凝胶发生可逆的溶胀和收缩，这通过交联位点诱导固定化蛋白质的相应结构破坏和恢复，从而实现可逆的Zn²⁺吸附。Zap1zf12包含两个Cys₂His₂型锌指结构域，每个结构域由四个用于Zn²⁺配位的关键残基组成。第一个结构域的配位残基是Cys5、Cys10、His23和His28，而第二个结构域的配位残基是Cys42、Cys47、His60和His65。在每个锌指中仔细设计交联位点对于实现PNIPAM驱动的Zn²⁺捕获和释放至关重要。先前的研究，包括PNIPAM-co-CadRpep（一种镉吸附水凝胶）的开发和PNIPAM-co-SUP（一种铀吸附水凝胶）中交联位点的研究，为交联位点设计提供了宝贵的见解。例如，单个交联位点可能无法有效调节蛋白质功能，而将交联位点放置在关键残基附近可以增强调控能力。此外，任何不参与交联的赖氨酸残基都应替换为精氨酸，以防止意外的修饰。因此，最好基于Zap1zf12中的赖氨酸残基（Lys6、Lys8、Lys26和Lys34）设计交联位点，因为这种方法可以最大限度地减少引入额外突变可能带来的不利影响。

设计了四种Zap1zf12变体来探索最佳交联位置。在对照突变体Zap1zf12-I（K6R, K8R, K26R, K34R）中，所有赖氨酸残基都突变为精氨酸，只留下N末端残基可用作交联位点。Zap1zf12 V（K6R, K8E, E9K, K34R, D46K, A63K）被设计为每个锌指有两个交联位点，总共产生五个位点。对于第一个锌指，保留了天然的Lys26用于交联。选择Glu9而不是Lys8，因为它更靠近关键残基Cys10，并且表现出更有利的取向以实现高效拉伸。对于第二个锌指，选择Asp46和Ala63进行交联。这两个残基朝向相反的方向，分别位于关键位点Cys47和His65附近。Zap1zf12-III（K6R, K8E, E9K, K26R, K34R, A63K）和Zap1zf12-IV（K6R, K8E, E9K, K26R, A63K）源自Zap1zf12 V，旨在研究简化的交联位点设计是否能够支持双位点蛋白质杂化水凝胶中的可逆捕获-释放行为。这些变体分别包含三个或四个交联位点（包括N末端位点）。

构建、表达和纯化了野生型Zap1zf12及其所有变体，随后进行了锌结合亲和力测定。所有四种变体（Zap1zf12-I至Zap1zf12 V）都表现出与野生型蛋白质相当的锌结合亲和力，第一个锌指的解离常数（K_d）在10^–10M范围内，第二个锌指在10^–6M²范围内。这些结果表明，Zap1zf12变体中的突变并未显著影响其Zn²⁺结合亲和力。

3.2. 蛋白质修饰策略

在交联到水凝胶中之前，蛋白质N末端位点的α-NH₂基团和赖氨酸残基的ε-NH₂基团通过NAS修饰引入丙烯酰基。在NAS修饰之前，将Zn²⁺结合到蛋白质上以保护关键残基。没有这种保护，蛋白质的锌结合亲和力显著下降，并且交联位点修饰的特异性受到不利影响。NAS修饰适度影响了Zap1zf12突变体的Zn²⁺结合亲和力。在正确修饰后，所有突变体的第一个锌指的K_d值从10^–10M范围转移到10^–9M范围，而第二个锌指的结合亲和力基本不受影响。尽管Zn²⁺结合亲和力下降了一个数量级，但纳摩尔级的K_d值仍然足以让Zap1zf12突变体有效地捕获溶液中的Zn²⁺。

3.3. 基于Zap1zf12的杂化水凝胶的表征

在SDS-PAGE分析中，NIPAM聚合蛋白质的条带明显上移，表明修饰后的蛋白质已掺入PNIPAM网络中。差示扫描量热法（DSC）结果显示，杂化水凝胶的LCST随着蛋白质浓度的增加而增加，进一步证实了蛋白质-水凝胶的交联。温度在25°C和37°C之间切换对Zap1zf12的Zn²⁺结合能力或整体结构影响很小。相比之下，水凝胶基质在这些温度变化过程中表现出剧烈的形状变化，产生的拉伸力可能有助于破坏蛋白质结合结构，从而促进有效的Zn²⁺捕获和释放。此外，水凝胶的多孔结构支持交联蛋白质与处理溶液之间的离子交换。

分析了Zn²⁺释放率（即水凝胶释放的Zn²⁺量/水凝胶捕获的Zn²⁺量），以确定Zap1zf12中用于有效Zn²⁺捕获和释放调控的最佳交联位点设计。Zap1zf12-I杂化水凝胶表现出较低的Zn²⁺释放率，为14.1 ± 3.6%，表明单个交联位点可以固定蛋白质用于Zn²⁺捕获，但不足以实现充分的Zn²⁺释放。相比之下，PNIPAM-co-Zap1zf12 V表现出最佳的捕获-释放性能，97.1 ± 9.8%的结合Zn²⁺成功解吸。在该构建体中，Zap1zf12 V的每个锌指包含两个朝向相反的交联位点，位于关键残基附近。这种排列促进了当PNIPAM网络在LCST以下溶胀时配位结构的高效破坏，从而削弱了Zn²⁺结合。相反，当网络在LCST以上收缩时，配位结构得以恢复，从而实现可逆的Zn²⁺吸附。Zap1zf12-III和Zap1zf12-IV的简化设计未能达到相当的效率，释放率分别仅为63.9 ± 2.6%和80.9 ± 8.6%。总体而言，结果表明Zap1zf12中的战略性交联位点工程对于优化可逆Zn²⁺吸附至关重要。因此选择Zap1zf12 V用于构建PNIPAM-co-Zap1zf12。

进一步优化了反应温度、蛋白质用量和蛋白质添加时间，以优化杂化水凝胶系统。通过分析溶胀比和Zn²⁺捕获-释放能力来评估性能。在25°C制备的水凝胶表现出最高的溶胀比，而蛋白质添加延迟1分钟导致最大的Zn²⁺吸附。虽然添加1.0 mg蛋白质增加了Zn²⁺捕获能力，但过量的蛋白质掺入也增加了交联密度，这反过来又阻碍了Zn²⁺释放过程中水凝胶的完全收缩，并降低了整体释放率。因此，最终确定最佳条件如下：反应温度25°C，每个水凝胶添加0.7 mg Zap1zf12 V蛋白，蛋白质添加延迟1分钟。

3.4. 基于Zap1zf12的杂化水凝胶在Zn²⁺去除中的应用

使用优化的杂化水凝胶进行Zn²⁺吸附，可将Zn²⁺浓度从微摩尔范围降低到数十纳摩尔水平。PNIPAM没有显示出显著的Zn²⁺去除，表明吸附是由交联的Zap1zf12蛋白介导的。在含有804.1 ± 41.9 nmol/L Zn²⁺的系统中，PNIPAM-co-Zap1zf12去除了98.4 ± 7.3%的Zn²⁺，溶液中仅留下12.6 ± 5.8 nmol/L。在另一个含有1.4 ± 0.1 μmol/L Zn²⁺的系统中，残留Zn²⁺浓度为65.5 ± 17.7 nmol/L，对应于95.2 ± 12.3%的去除率。饱和结合实验表明，该水凝胶达到了其理论最大结合容量的66.2 ± 8.2%，这与先前报道的PNIPAM-co-CadRP相似。PNIPAM-co-Zap1zf12在多个捕获-释放循环中保持了稳定的性能，在四个循环中吸附一致，仅在第五个循环中略有下降。

该水凝胶还表现出显著的选择性，主要结合Zn²⁺，未检测到对Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺或Mn²⁺的吸附。观察到对Co²⁺、Ni²⁺和Cu²⁺的轻微吸附。然而，这些金属在培养基中通常以低浓度存在，与高水平的Mg²⁺、Ca²⁺和Fe³⁺形成对比。因此，意外的结合对PNIPAM-co-Zap1zf12的Zn²⁺去除性能影响最小。这种Zn²⁺选择性行为在重复的捕获-释放循环中得以保持。此外，PNIPAM-co-Zap1zf12在5-8的pH范围内表现出稳定的Zn²⁺吸附，涵盖了常见培养基的典型pH。

评估了PNIPAM-co-Zap1zf12在各种培养基中选择性去除Zn²⁺的实际应用。为了建立酿酒酵母的锌耗尽培养条件，酵母氮基培养基中的Zn²⁺浓度应保持在100 nmol/L以下。然而，由于锌的普遍存在，即使不添加锌盐，它也常常超过这个限度。传统上，使用Chelex 100树脂去除背景过量的Zn²⁺，然后重新补充其他必需金属离子。在实验中，Chelex 100将Zn²⁺从306.9 ± 19.0 nmol/L降低到48.9 ± 15.7 nmol/L，同时去除了约70%的其他金属离子，包括Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺。相比之下，PNIPAM-co-Zap1zf12实现了相当的Zn²⁺消耗，对其他金属离子的影响最小，仅显示Cu²⁺略有减少。剩余的Zn²