《ACS Omega》：UA-DMSPE Determination of Cu(II), Cd(II), and As(III) in Water, Soil, and Tomato Using a Novel Thiosemicarbazone Sorbent: ICP-OES Performance with DFT Characterization and Antimicrobial-Target Docking
引言
重金属如Cu(II)、Cd(II)和As(III)由于其毒性、生物累积性和在生态系统中的持久性，对环境和人类健康构成重大威胁。特别是镉和砷，即使在痕量浓度下，长期暴露也会产生肾毒性、神经毒性和致癌效应。因此，在自然水源和饮用水中准确、灵敏、选择性地测定这些金属是环境监测的关键挑战之一。尽管ICP-OES和ICP-MS等光谱技术具有高灵敏度，但复杂环境基质中这些金属的超痕量水平需要有效的预富集策略以确保可靠定量。在各种样品制备技术中，分散微固相萃取（DMSPE）因其快速的相相互作用、低溶剂消耗和无需洗脱步骤而受到相当多的关注。
除了水基质，Cu(II)、Cd(II)和As(III)等重金属在土壤中的积累也构成严重的生态和农业威胁。然而，土壤中重金属的准确测定因其在异质矿物相上的强吸附、与腐殖质的结合以及位点特异性变异而变得复杂，这些都可能掩盖真实的分析物浓度并阻碍重现性。在金属污染土壤中种植的蔬菜（如番茄）可以吸收这些元素，并通过直接或动物源性产品将其引入人类食物链。这种暴露途径可能导致严重的健康影响，包括胃肠道和呼吸系统疾病、肝毒性甚至癌症。此外，土壤中的微量金属平衡，包括Zn、Fe和Cu等必需元素，显著影响植物健康和作物生产力。虽然微量营养素对生长至关重要，但某些金属（如Al、Fe）的过量水平可能对土壤肥力产生负面影响。因此，土壤中的痕量金属分析不仅对毒理学评估至关重要，也对可持续农业实践至关重要。
植物基质，特别是可食用蔬菜，也是环境污染的有价值指标。然而，由于多步预处理要求（清洗、干燥、研磨、消解）和基质的高有机含量，植物组织中的准确监测仍然具有挑战性，这可能在制备过程中引起光谱干扰和分析物损失。Ca、K和Mg等主要元素，以及Fe、Zn、Mn、Cu和Se等微量必需元素，对人类新陈代谢至关重要。然而，它们的过量或缺乏可能导致各种疾病，而Cd、Pb、As和Hg等有毒元素即使在非常低的浓度下也可能构成严重的健康风险。电感耦合等离子体光学发射光谱法（ICP-OES）由于其多元素检测、宽线性范围和低检测限，仍然是植物样品中元素分析的领先技术。然而，对固体植物基质（如蔬菜）的准确分析需要在仪器测量之前进行多步样品制备，包括清洗、干燥、研磨、酸消解和过滤。根据绿色分析化学的原则，近期的努力集中在最小化试剂使用、简化程序以及提高此类分析工作流程的环境可持续性。
DMSPE中的一个关键因素是选择合适的螯合剂，该螯合剂应具有快速络合、水溶性和在宽pH范围内的稳定性。在这方面，缩氨基硫脲（TSCs）因其多齿性质和通用的配位行为而成为高效的配体，特别是对软金属离子如Cu(II)、Cd(II)和As(III)。文献显示，TSC配体不仅提高了金属萃取的分析性能，还显示出显著的生物活性，包括抗菌、抗真菌、抗结核和抗癌特性。此外，将含氮杂环（如吡唑环）纳入TSC结构已被证明可以增强配位能力和药理潜力。这些结构特征增加了细胞膜通透性和生物靶点相互作用，拓宽了它们在药物化学中的应用。基于TSC的金属配合物，特别是与Cu(II)、Ni(II)、Co(II)、Pt(II)和Ru(II)的配合物，已针对各种细菌菌株和肿瘤细胞系显示出有希望的结果。
近期研究也证明了纳米颗粒功能化吸附剂的潜力，例如涂覆有聚(8-羟基喹啉)的Fe3O4磁性核，用于从复杂基质（如土壤、番茄和水样）中选择性和高效地萃取Cu(II)。这些材料提供了优异的表面积、可调的选择性和低检测限，同时其磁响应性便于快速分离而无需离心。选择水、土壤和番茄基质是为了涵盖不同但互补的暴露途径：水作为人类消费和农业应用的直接途径，土壤作为主要的环境储库和污染源，番茄作为广泛消费的代表性可食用作物，具有从污染土壤中积累痕量金属的能力。
在本研究中，报道了一种文献中先前未描述的新型缩氨基硫脲衍生物的合成和结构表征。合成的配体被共价固定到硅胶基吸附剂上，并应用于UA-DMSPE程序，用于从环境水、土壤和番茄样品中选择性萃取和富集Cu(II)、Cd(II)和As(III)，然后通过ICP-OES进行定量。在这方面，本研究中开发的UA-DMSPE方法最大限度地减少了样品处理步骤，减少了基质干扰，并提高了回收效率，从而解决了通常与土壤和植物基质相关的许多局限性。这项工作的新颖之处在于将新设计的TSC衍生物与UA-DMSPE相结合，以在痕量水平下实现高回收率和改进的重现性。此外，DFT计算和对接研究的整合提供了一个独特的跨学科视角，加强了环境监测应用和配体的潜在生物医学相关性。
实验部分
化学品与试剂
用于合成缩氨基硫脲衍生物的所有试剂和溶剂均为分析纯，购自Merck、Fluka或Riedel-de Ha?n。硅胶（70-230目）用作支撑材料。分析研究使用的金属盐，包括CuCl2、CdCl2和NaAsO2，购自Merck、Sigma-Aldrich或Alfa Aesar。Cu(II)、Cd(II)和As(III)的储备液和标准溶液用超纯水配制，并在+4°C下储存。工作溶液通过储备液的适当稀释每日新鲜配制。合成化合物的熔点使用数字电热熔点仪（Gallenkamp）在密封毛细管中测定。
合成化合物的结构表征使用高分辨率Bruker WH-400傅里叶变换核磁共振谱仪进行1H NMR光谱分析。FTIR光谱使用PerkinElmer Spectrum BX-II仪器记录。元素组成（C、H、N、S）使用LECO CHNS-O-9320元素分析仪测定。吸附剂的表面形态和元素组成通过扫描电子显微镜（SEM）结合能量色散X射线光谱（EDX）进行检查，使用配备钨电子源的Zeiss Evo HD15系统。
超声辅助萃取程序在Bandelin超声浴中进行。整个实验过程中使用的超纯水由Thermo Scientific Smart2Pure Pro系统供应。金属离子的定量分析使用Varian 710-ES电感耦合等离子体光学发射光谱仪（ICP-OES）进行。用于测定Cu(II)、Cd(II)和As(III)的发射波长分别为324.75、228.80和193.70 nm。
样品制备
复杂基质（如环境水、土壤和植物组织）中痕量金属的准确测定需要精心设计的样品制备步骤，以确保可靠性、重现性和最小的基质干扰。
水样
地表水和灌溉水样使用预清洗的聚乙烯瓶从Gediz河流域（土耳其）内的各个农业区收集。样品通过0.45 μm膜过滤器过滤以去除悬浮颗粒，并在4°C下储存直至分析。在萃取前，将每个水样的pH值用稀HCl或NaOH溶液调节至6.0，以优化UA-DMSPE过程中金属-配体络合。
土壤样品
土壤样本取自同一区域农田表层0-15厘米。样品在受控实验室条件下风干后，去除可见碎屑和植物残留物。将干燥的土壤用研钵研磨，并通过0.5毫米筛子以获得均匀的粒度。对于消解，将1.0克每种土壤样品与6毫升浓HNO3和2毫升30% H2O2在聚四氟乙烯消解罐中处理。混合物使用微波辅助系统进行逐步加热程序，直至完全矿化。消解液冷却、过滤并用超纯水稀释至30毫升后进行金属分析。
番茄样品
番茄果实从Gediz流域内选定的农业地点收集，仅保留可食用部分用于痕量金属测定。为消除附着土壤颗粒和大气污染物，样品首先用自来水彻底冲洗，然后用去离子水多次清洗。清洁后的材料随后在60°C的烘箱中干燥24-48小时，直至达到恒重，确保完全去除水分而不引起目标分析物的热降解。干燥的组织随后使用玛瑙研钵和杵研磨成均匀的细粉，并将粉末储存在气密聚乙烯容器中以防止污染和吸湿。对于样品消解，将0.5克粉末材料与6毫升浓HNO3和2毫升30% H2O2在微波辅助消解系统中进行湿法酸分解，采用五步升温程序。冷却至室温后，消解液过滤并用超纯水定量稀释至25毫升，然后进行ICP-OES分析。
整体制备策略根据绿色分析化学的原则进行了优化，目标是最大限度地减少试剂消耗、最大化分析物回收率并提高与复杂生物基质的兼容性。
(E)-2-((3-溴苯并[b]噻吩-2-基)亚甲基)-N,N-二甲基肼-1-羧硫代酰胺的合成
(E)-2-((3-溴苯并[b]噻吩-2-基)亚甲基)-N,N-二甲基肼-1-羧硫代酰胺按照报道的程序合成。它是通过N,N-二甲基肼羧硫代酰胺（0.06克，0.5毫摩尔）和3-溴苯并[b]噻吩-2-甲醛（0.121克，0.5毫摩尔）在20毫升无水乙醇中的缩合反应获得的。为促进反应，加入2-3滴冰醋酸，混合物在恒定搅拌下回流5小时。通过薄层色谱（TLC）监测进程。完成后，将混合物冷却至室温，得到黄色结晶固体。产物过滤，依次用冷甲醇和乙醚洗涤，并从二氯甲烷中重结晶以获得纯化的配体。产率：76%；黄色粉末；熔点203°C。
吸附剂的制备
在功能化之前，硅胶用0.5 M HNO3预处理以去除残留污染物。彻底酸洗后，用去离子水反复冲洗直至达到中性pH。随后，将1.5克活化的硅胶与15毫升合成的缩氨基硫脲（TSC）衍生物(E)-2-((3-溴苯并[b]噻吩-2-基)亚甲基)-N,N-二甲基肼-1-羧硫代酰胺的1 × 10–4mol L–1氯仿溶液混合。混合物在环境温度下搅拌24小时以促进固定化。所得材料使用烧结玻璃漏斗通过真空过滤收集。为去除任何物理吸附的配体，功能化硅胶用氯仿彻底洗涤，随后用超纯水洗涤。最终产物在真空下干燥并储存在干燥器中直至进一步使用。
超声辅助分散微固相萃取程序（UA-DMSPE）
将10毫升的250 μg L–1标准金属混合物或消解后的土壤样品（通过微波辅助酸消解制备）等分转移到含有40毫克TSC功能化硅胶吸附剂的聚丙烯离心管中。悬浮液在环境温度下超声处理15分钟，以确保分析物与吸附剂表面之间的有效相互作用。然后以5000 rpm离心10分钟，弃去上清液。对于保留金属离子的解吸，向沉淀物中加入0.5毫升1 mol L–1HNO3，随后超声处理10分钟。混合物再次以5000 rpm离心10分钟。所得上清液通过0.45 μm膜过滤器以去除残留颗粒物，然后进行分析。滤液通过ICP-OES分析以定量Cu(II)、Cd(II)和As(III)离子。
蛋白质建模
蛋白质（PDB ID：3KFD、5YEI、6Y2E）的三维结构使用BIOVIA Discovery Studio构建。在建模过程中，选择了提供最高序列覆盖率和最佳分辨率的模板以确保结构准确性。结果显示，所得蛋白质模型表现出不同的构象，这可归因于氨基酸组成和分子内相互作用的差异。
分子对接
在3KFD、5YEI和6Y2E蛋白质的结构建模之后，使用CB-Dock2进行分子对接分析，以合成的缩氨基硫脲衍生物作为配体。CB-Dock2利用空腔中心预测算法识别潜在结合区域并估计结合亲和力。对于每种蛋白质，检测到五个结合口袋，并根据其计算的结合能进行排序，从而可以优先考虑最有利的相互作用位点。
密度泛函理论（DFT）
进行密度泛函理论（DFT）计算以研究合成的缩氨基硫脲配体的电子性质。分子草图绘制和结构建模使用ChemDraw和Avogadro进行，而几何优化和电子结构计算使用GaussView 5.0和Gaussian 09W进行。优化几何结构在B3LYP/6-311G(d,p)理论水平上获得，适用于C、N、O和H原子，以确保稳定的构型和可靠的电子描述。
生成分子静电势（MEP）图以可视化分子的亲电和亲核区域。在这些图中，有利于亲核攻击的缺电子区域显示为蓝色，而易受亲电攻击的富电子区域以红色表示；中性区域显示为绿色。
还进行了前沿分子轨道（FMO）分析，重点是最髙占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）。HOMO表示分子的给电子能力，而LUMO反映分子的受电子趋势。HOMO–LUMO能隙（ΔEgap）定义为这些轨道之间的差值，是化学反应性和稳定性的关键描述符。较大的ΔEgap对应于较高的稳定性和较低的反应性，而较小的ΔEgap表明反应性增强。
基于FMO结果，使用文献中报道的标准方程计算了几个全局反应性描述符，包括电离势（I）、电子亲和势（EA）、电负性（χ）、化学硬度（η）、软度（σ）、化学势（μ）和亲电性指数（ω）。
结果与讨论
Si-Carb-甲臜的表征
使用FTIR光谱和SEM-EDX分析对合成的硅胶基吸附剂（用缩氨基硫脲（TSC）配体修饰）进行结构表征。如图3所示，FTIR光谱为硅胶支撑体和有机配体的存在提供了清晰的证据。在未改性硅胶（红色）的光谱中，在3436 cm–1附近的宽吸收归因于表面硅醇基团的O–H伸缩振动，而在1090 cm–1附近的明显峰表明Si–O–Si键的不对称伸缩。在966和808 cm–1之间的额外谱带归属于与Si–O和Si–OH官能团相关的弯曲振动。
纯TSC配体光谱（黑色）显示在3429 cm–1处有一个宽谱带，对应于N–H伸缩振动。在1542 cm–1处的强吸收证实了亚胺基团（C═N）的存在，这是TSC的关键结构特征。此外，在2956和2771 cm–1处的峰与脂肪族C–H伸缩模式一致，在1248和1018 cm–1之间的范围显示了特征性的C–N伸缩振动。
在功能化硅胶材料（蓝色）的光谱中，观察到来自硅胶基质和有机配体的吸收特征，表明成功的共价接枝。在1543 cm–1处亚胺C═N谱带的持续存在表明TSC在固定化后保留了其结构特性。在3426 cm–1处的宽信号表明来自硅胶和配体部分的O–H和N–H伸缩振动重叠。此外，在1109 cm–1处的强谱带通过Si–O–Si振动证实了硅胶骨架的结构完整性，在2962和2770 cm–1处的峰支持了与配体相关的脂肪族C–H基团的存在。总之，这些光谱观察结果最终验证了TSC配体通过化学键合相互作用成功功能化了硅胶表面。
使用扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDX）和元素映射技术在金属离子吸附前后评估了TSC功能化硅胶吸附剂的形态和元素特征。如图4所示，在金属结合之前获得的SEM显微照片显示出相对均匀且多孔的表面拓扑结构。在吸附过程之后，观察到明显的形态变化，包括表面粗糙度增加和颗粒团聚，表明吸附剂与金属离子之间的相互作用。
此外，原始吸附剂的EDX光谱分析证实了仅存在硅（Si）和氧（O），与硅胶基质一致。然而，在暴露于含金属样品后，EDX光谱中出现了对应于砷（As）、镉（Cd）和铜（Cu）的新峰，表明这些金属离子被吸附剂成功捕获。互补的EDX映射进一步证实这些金属离子均匀分布在材料表面，提供了有效且均匀吸附的视觉证据。这些发现共同验证了所制备吸附剂从复杂基质中选择性和高效吸附As(III)、Cd(II)和Cu(II)离子的能力。
元素分析结果与分子式C12H12BrN3S2的计算值基本一致。FTIR光谱显示了N–H、C═N、N–N、C═S以及噻吩和苯环伸缩振动的特征吸收峰。1H NMR和13C NMR谱图数据与目标化合物的结构相符。
方法优化研究
为提高超声辅助分散微固相萃取（UA-DMSPE）程序的效率，系统地优化了实验参数。优化考虑了关键变量，包括样品pH、吸附剂用量、萃取时间以及洗脱液的类型和体积。应用单因素（OFAT）方法，其中每个变量单独改变，而其他变量保持不变，从而能够独立评估其对Cu(II)、Cd(II)和As(III)回收率的影响。选择产生最高回收效率的条件作为最佳条件。这种经典的OFAT策略为优化UA-DMSPE方法提供了一个简单有效的框架，而无需应用复杂的统计或多变量方法。
配体浓度的影响
在UA-DMSPE技术中，金属离子萃取的效率受吸附剂表面固定化配体量的高度影响。正如先前报告所支持的，配体浓度不足可能导致与目标金属离子的络合不良，而过高的配体密度可能导致空间位阻或过饱和效应，最终降低吸附性能。为研究这一点，通过用不同浓度（1 × 10–5、5 × 10–5、1 × 10–4和5 × 10–4mol L–1）的希夫碱配体溶液功能化1克活化硅胶来制备吸附剂。所得材料应用于UA-DMSPE程序，并评估了Cu(II)、Cd(II)和As(III)的保留效率。
如图7所示，增加配体浓度导致金属回收率显著提高，在1 × 10–4mol L–1时达到最大值：Cu(II)为91.3%，Cd(II)为91.0%，As(III)为89.5%。超过此浓度，回收率略有下降，可能是由于过度的配体覆盖导致扩散或空间限制。因此，选择使用1 × 10–4mol L–1配体浓度制备的吸附剂作为最佳条件，用于后续萃取。
洗脱液选择和体积优化
为研究洗脱液类型对解吸效率的影响，评估了几种酸溶液，包括硝酸（HNO3）和盐酸（HCl），浓度分别为0.5和1 M，在水中和甲醇中配制。如图7所示，使用1 M HNO3水溶液获得最高的金属回收率（59.1%），表明其与其他洗脱液相比具有优异的洗脱能力。这种提高的效率可归因于硝酸更强的氧化性及其更有效地破坏吸附剂表面上的金属-配体相互作用。相比之下，使用HNO3甲醇溶液或较低浓度的HCl导致回收率显著降低，可能是由于酸强度较弱或溶剂渗透效果较差。这些发现支持选择1 M水性HNO3作为UA-DMSPE程序最合适的洗脱液，与先前研究中的类似观察结果一致。
洗脱液体积在确保分析物从吸附剂上完全解吸而不引起分析物稀释方面起着至关重要的作用。在本研究中，测试了不同体积（0.25、0.5、1.0、1.5和2.0毫升）的1 M HNO3水溶液，并记录了它们对Cu(II)、Cd(II)和As(III)回收效率的影响。如图7所示，回收值随着洗脱液体积增加而稳步增加，直至0.5毫升，之后观察到轻微下降。这种趋势可能是由于在最佳体积下洗脱液-吸附剂相互作用改善，促进了有效的解吸，而过量的洗脱液体积可能稀释分析物或超过吸附剂的释放能力。基于这些结果，选择0.5毫升1 M HNO3作为进一步实验的最佳洗脱液体积，平衡了最大回收率和最小稀释效应。
pH优化
在pH 3-10范围内彻底研究了样品pH对Cu(II)、Cd(II)和As(III)离子回收率的影响，以确定最佳萃取条件。如图8所示，所有三种分析物的回收效率在低pH值（3-4）下显著降低，这可能是由于高浓度的H+离子与金属离子竞争吸附剂表面的活性结合位点。在pH 3时，
