《ACS Omega》：Biochemical and Mechanistic Insights into O2 Scavenging and Stability of the Soluble Hydrogenase from Hydrogenophaga pseudoflava
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本综述深入探讨了嗜氢假单胞菌（Hydrogenophaga pseudoflava）来源的可溶性氢酶（HpSH）的生化特性与机制。研究揭示HpSH具有卓越的O2耐受性，能通过独特的催化机制清除O2，并展现出比经典模型酶（CnSH）更广的辅因子谱（包括NADP+、FMN、FAD）和显著增强的稳定性（半衰期达46小时）。该酶在微氧/厌氧环境下可实现高效的NAD(P)H再生，总转化数（TTN）高达2.23×105，为生物技术应用（如生物催化辅因子再生）提供了极具潜力的工具。
引言
分子氢（H2）是一种清洁的高能还原剂，氢酶能够催化H2可逆氧化为质子和电子（H2? 2H++ 2e–）的反应。根据其活性位点结合的金属辅因子，氢酶可分为[Fe]、[FeFe]和[NiFe]-氢酶三类。与对氧气敏感的[FeFe]氢酶不同，部分[NiFe]-氢酶表现出对O2的耐受性，使其能在有氧条件下保持催化活性。其中，来自雷氏菌（Cupriavidus necator）的双向可溶性氢酶（CnSH）已成为H2驱动的NAD(P)+/NAD(P)H和黄素辅因子再生的基石。CnSH是一个六聚体复合物（HoxFUYHI2），包含氢酶模块（HoxYH）、黄递酶模块（HoxFU）和调节性HoxI二聚体。来自H2氧化的电子从Ni-Fe活性位点出发，经由铁硫簇和FMN传递，最终在黄递酶模块还原NAD+。
近期，对嗜氢假单胞菌（Hydrogenophaga pseudoflava）DSM 1084的基因注释显示，其存在与Ni-Fe、FMN、NADP+辅因子以及铁硫簇结合的保守区域，表明其酶属于[NiFe]第3组氢酶，即辅因子耦合的双向[NiFe]-氢酶。注释基因显示，四个基因（HoxHYFU）与CnSH的结构亚基具有同源性。有趣的是，嗜氢假单胞菌是一种好氧的羧基营养型Knallgas细菌，因此其可溶性氢酶（HpSH）可能也具有氧耐受性。本研究首次建立了HpSH的同源过表达和纯化系统，并进行了全面的生化分析，同时与CnSH的现有数据进行了比较。最后，阐明了其特征性滞后阶段的起源和机制，并验证了其NADH再生效能。
结果
表达产量与纯度
研究人员开发了HpSH的过表达系统。通过质粒方法，将携带结构亚基（HoxHYFU）编码基因和HoxH成熟所需的内肽酶（HoxW）基因的操纵子导入其天然宿主。与C. necator不同，未发现HoxI基因。为了便于通过Strep-Tactin基质进行亲和纯化，在HoxF亚基的N端克隆了Strep-Tag。纯化后的HpSH产量为0.67 mg L–1，包含四个表达的亚基。纯化后的HpSH的SDS-PAGE和UV-vis光谱与CnSH相似。HoxH和HoxU的条带大小与预期不完全一致，这可能与亚基的氨基酸组成影响其在凝胶中的迁移行为有关。此外，观察到的条带显示HoxF的丰度明显高于其他亚基，这可能是因为纯化过程中部分四聚体酶失去了完整性，或者好氧条件下的培养和纯化过程损害了酶的四级结构。
HpSH的活性与滞后阶段
最初，纯化的酶未显示出H2驱动的NAD+还原活性。一种可能的解释是黄递酶模块失活。为了测试氢酶模块是否能够氧化H2，将酶与亚甲蓝一起孵育，因为亚甲蓝可以独立于黄递酶接受电子。起初未能检测到亚甲蓝的还原，但当酶与H2和亚甲蓝共同放置过夜后，氧化还原染料被还原，对亚甲蓝的比活性相对较低，约为30 mU mg–1。这强烈表明存在低催化速率或滞后阶段。为了验证这一发现是否适用于H2驱动的NAD+还原，研究人员延长了活性测量时间，观察到大约30分钟后活性急剧上升，表明HpSH在经过较长的滞后阶段后能够还原NAD+。随后，将测定时间延长至90分钟，以确定HpSH的最佳性能参数。
生化特性分析
从温度开始，研究人员测试了HpSH在20至50 °C下的活性，观察到最适温度为30 °C，与CnSH的最适温度接近，在50 °C时活性显著下降。
接着，研究人员通过测试KCl和NaCl对酶活性的影响来研究离子强度稳定性。盐浓度的增加导致酶的比活性降低，但酶对KCl和NaCl的耐受性似乎相同。HpSH对NaCl的耐受性高于CnSH。在100 mM NaCl下，HpSH仍保持75%的残余活性，而CnSH仅保留30%。
关于pH最适点，测试了pH 5.5至9的范围。在中性pH 7.0时观察到最大活性为33.8 ± 1.3 U mg–1，这与CnSH不同，后者偏好更碱性的pH 8.0–8.5，在pH 7时活性损失33%。
为了评估HpSH在中性pH下用于辅因子再生的潜力，研究人员探索了HpSH的辅因子谱。测试了HpSH对黄素辅因子和NADP+的活性。HpSH对每种辅因子都显示出活性。值得注意的是，HpSH还原NADP+的比活性为0.8 U mg–1，超过了天然CnSH，达到了迄今为止最好的NADP+工程变体CnSHE341A/S342R活性的80%。HpSH还能够转化FAD和FMN，其活性显著高于CnSH，对FAD和FMN的活性分别达到1.9 U mg–1和8.5 U mg–1。与CnSH相比，这分别对应FAD和FMN活性的10倍和1.5倍。未来研究值得探讨HpSH是否能像CnSH一样还原合成辅因子。
随后，研究人员在pH 7、50 mM Tris、无额外盐、30 °C的优化条件下，使用NAD+测定了催化参数。测定的KM值为0.4 ± 0.14 mM，kcat为137 ± 20 s–1。由此得出NAD+的催化效率（kcat/KM）为2.3 × 105M–1s–1，低于但仍可与CnSH相媲美。
由于NADP+的活性太低，且黄素辅因子（尤其是FAD）的转化表现出显著较长的滞后阶段，无法测定其他辅因子的催化参数。
最后，研究人员通过在30 °C和pH 7下孵育酶来测试HpSH的稳定性。即使在72小时后，酶仍保持26%的残余活性，半衰期约为46小时。这超过了CnSH在25 °C下半衰期10小时、在35 °C下仅5小时的稳定性。需要注意的是，HpSH制备物可能含有高比例的不完全组装复合物，这意味着观察到的活性是表观kcat值，实际活性可能更高。提高酶的完整性需要优化步骤，如共表达成熟机制以及改进培养和纯化方案。
滞后阶段研究
有趣的是，观察到的滞后阶段长度在不同温度、pH和盐浓度下有所不同。由于HpSH是在有氧条件下纯化的，研究人员假设残留的O2是导致滞后阶段延长的原因，正如其他氢酶中报道的那样。为了研究这一点，测试了O2含量对HpSH活性和滞后阶段的影响。将H2与O2饱和的缓冲液按给定浓度混合。O2的存在似乎影响了HpSH的活性。乍一看，添加1%（v/v）的O2饱和缓冲液使HpSH的活性降低了约20%；然而，进一步增加O2似乎并未加剧这种效应。对所有测量数据点（包括无O2的样品）进行ANOVA检验，得到的p值为0.27，表明观察到的变化无统计学意义。因此，O2的量对HpSH的活性没有明显影响。
另一方面，O2含量对延长滞后阶段有显著影响（p值为1.06 x10–6）。10%的O2浓度导致滞后阶段长达3小时。在20%和40%的O2浓度下未能检测到活性。目前尚不清楚这反映了酶在高浓度下确实无法清除O2，还是实验假象（可能是由于在30 °C下长时间孵育影响了反应容器的气密性）所致。
机制探讨
为了进一步了解HpSH中O2解毒的机制，研究人员进行了一系列测试。首先，分析了每个滞后阶段结束时产生的H2O2浓度。这揭示了初始O2浓度与产生的H2O2之间存在明显的相关性。这一发现支持了我们的假设，即与CnSH类似，HpSH可以通过将O2还原为H2O2来解毒。
更有趣的是，将HpSH与催化量的NADH一起孵育，并未像在CnSH中观察到的那样缩短滞后阶段，反而延长了它。在活性测定期间添加催化量的NADH和NADPH也观察到相同的趋势，其中NADPH引起的影响显著更大。这表明NADH和NADPH可能对HpSH具有调节作用，这与CnSH不同。
此外，当在无H2条件下使用苄基紫精分析黄递酶活性时，在厌氧条件下观察到11.7 U mg–1的高活性，且没有滞后阶段。这表明HpSH的黄递酶结构域功能独立于氢酶模块及其活性。此外，研究人员在厌氧条件下使用木糖脱氢酶（XDH）的耦合系统测试了逆反应——从NADH到H2。在该设置中，观察到大约30秒的非常短的滞后阶段后即有H2形成，表明在无O2情况下，电子从NADH到Ni-Fe中心的转移是快速发生的。需要注意的是，XDH-氢酶耦合系统需要0.1 mM FMN。正如预期，FMN的黄色在还原后变为无色。这种还原的黄素可以通过快速的解偶联反应迅速消除残留的O2，从而维持无O2环境。
为了测试NADH是否是O2解毒的电子来源，进行了H2驱动的NAD+还原测定。在激活HpSH后，引入O2，立即观察到NADH形成停止。随后NADH信号逐渐下降，表明其被氧化，推测是为了去除O2。由于浓度低于检测限，未能检测到H2O2。将HpSH仅与H2在厌氧条件下孵育没有活性，这证实了NADH（而非H2）是HpSH中消除残留推定O2的电子供体。
作为NADH再生系统的有效性验证
最后，为了强调HpSH在生物转化中用于辅因子再生的潜力，将HpSH与商业乳酸脱氢酶（LDH）耦合，以从丙酮酸生产乳酸。使用8 mL密封容器，内装1 mL含有1 mM NAD+和50 mM丙酮酸、并用H2饱和的缓冲液。通过添加酶启动反应。令人惊讶的是，当同时添加两种酶时，未检测到产物形成。由于LDH对NADH的KM值低于HpSH对NAD+的KM值，添加LDH会导致辅因子比例失衡，阻止HpSH自我激活。研究人员决定在线光谱监测反应，并在HpSH激活后添加LDH。通过HPLC分析样品显示，6小时后转化率高达75%。因此，研究人员确认了HpSH能够用作辅因子再生系统，其总转化数（TTN，μmol NADH再生量：μmol HpSH）为2.23 × 105，与CnSH相当。
讨论
NADH的影响，以及在生物转化过程中同时添加LDH和HpSH，为理解HpSH再活的潜在机制提供了一些线索。与真正耐氧的氢酶（如CnMBH，其特征是具有高O2耐受因子KIO2, app）不同，HpSH缺乏此类特征。KIO2, app定义为使H2氧化活性降低50%所需的O2浓度。这强调HpSH必须首先完全去除残留的O2，然后才能参与辅因子还原。因此，该酶更像是一种O2清除酶，O2充当强抑制剂，类似于蓝藻的氢酶。尽管如此，HpSH表现出良好的O2鲁棒性，因为只有其滞后阶段受O2浓度升高的影响，而其活性不受影响，这与其它氢酶中的类似现象一致。
HpSH的再活化速率是O2依赖性的，并且与先前描述其他氢酶中由O2引起的滞后阶段的报告一致。例如，CnSH表现出O2依赖的滞后阶段；然而，该阶段明显更短，持续时间约为1分钟。CnSH也可以通过NADH、NADPH（无论是否添加H2）重新激活。嗜热喜氢菌（Hydrogenophilus thermoluteolus）可溶性氢酶（HtSH）的滞后阶段通过添加还原剂或NADH会显著减少或完全消失。来自玫瑰色着色菌（Allochromatium vinosum）的[NiFe]-氢酶仅由H2激活，其滞后阶段与酶和H2浓度无关，表明是一个内在的激活过程。相比之下，HpSH似乎需要H2和少量自身产生的NADH才能重新激活。HpSH还表现出自动催化再活化行为，因为更高的酶浓度会缩短滞后阶段，这种现象在其他氢酶中也有观察到。单独添加NADH和NADPH——即使是催化量——似乎对HpSH有反作用。依赖于滞后阶段的自动催化激活过程，受酶和辅因子浓度或酶四级结构的影响，在其他氢酶中已有报道。
黄递酶在无H2情况下快速的NADH氧化活性，连同立即朝向H2生产的逆反应，表明反向电子传递是一个快速过程，并且NADH是O2还原的电子来源。
HpSH在添加O2后仍能产生H2O2并氧化NADH，这表明存在通过反向电子传递的还原激活机制，类似于CnSH。然而，也必须考虑到HpSH是一种黄素蛋白，H2O2可能通过还原黄素和O2之间的直接解偶联反应产生。但检测到的H2O2量并不等于系统中总的O2量，表明O2也被还原成了其他物质，很可能是水，正如在其他耐氧氢酶中观察到的那样。为了证实这一点，应使用同位素标记的O2，并验证同位素标记水的形成。
与LDH的功能表征表明NADH在再活化中起重要作用。考虑到添加NADH后观察到的滞后阶段延长，似乎HpSH的再活化是在H2和NADH协同下的顺序机制中运作的。
以下模型阐明了提出的再活化机制。当H2结合后，一小部分活性HpSH分子（那些Ni-Fe中心没有O2的分子）缓慢氧化H2并还原NAD+，从而产生少量NADH，这些NADH被迅速释放。产生的NADH可以结合到失活的HpSH分子（那些Ni-Fe中心带有O2的分子）上，并通过反向电子流还原O2（自动催化再活化）。O2还原发生在Ni-Fe中心或黄递酶模块，在那里从NADH转移氢化物还原黄素，随后黄素通过快速解偶联将其电子传递给O2。
仅存在NADH而无O2时，HpSH作为质子还原酶并产生H2。该模型解释了为何同时添加LDH会消除可检测的产物形成。LDH持续消耗由HpSH产生的少量NADH，从而维持滞后阶段，因为再活化变得仅依赖于H2。它也解释了在没有滞后阶段的情况下NADH和H2的快速氧化。目前尚无法解释在存在H2的情况下NAD(P)H的负面影响。同时添加两种还原剂NADH和H2可能导致电子传递停滞或改变Fe-S簇的氧化还原状态。NAD(P)H甚至在较低浓度下也可能表现出调节现象，例如与H2的负协同效应。然而，这两种解释都仍是高度推测性的；需要光谱和电化学分析来验证这些假设。
与CnSH相比，HpSH表现出更好的稳定性和更广的底物谱。
几个问题仍然阻碍HpSH在生物技术应用中的广泛使用。主要挑战是其在其天然宿主中的蛋白质产量低——约为CnSH的40倍——加上嗜氢假单胞菌生长速度慢，限制了其可扩展性。一个潜在的解决方案是将嗜氢假单胞菌的成熟机制整合到大肠杆菌中进行异源表达。值得注意的是，将CnSH机制转移到大肠杆菌中能够在大肠杆菌中生产有活性的HpSH，但活性与天然宿主相比显著降低。这种差异不仅可能源于成熟组分的不平衡，还可能表明HpSH的成熟可能遵循独特的途径或涉及活性位点修饰。需要光谱证据来进一步研究这种可能性。此外，与CnSH不同，HpSH表现出较长的O2清除滞后阶段，这限制了其在好氧设置中的应用。尽管如此，其卓越的稳定性为微氧和厌氧应用提供了有价值的折衷方案，同时与其他对O2更敏感的氢酶相比，提供了更易于处理的特性。
结论
研究人员成功生产并纯化了来自嗜氢假单胞菌的O2清除可溶性氢酶HpSH。HpSH催化H2驱动的NAD+还原，其比活性与CnSH相当，同时表现出卓越的稳定性，在30 °C下保持活性超过72小时，半衰期为46小时。HpSH还显示出比CnSH更好的NADP+、FMN和FAD还原活性。据我们所知，这种辅因子灵活性、氧化鲁棒性和长效活性的组合在任何双向氢酶中均属首次报道。该酶的延迟激活与O2水平相关，表明其存在与其他氢酶类似的解毒机制。值得注意的是，HpSH需要H2氛围和特定的NAD+/NADH比例才能激活。这突显了需要进一步研究其独特的激活机制及其活性位点的性质。
材料与方法
质粒与菌株构建
由于先前无法异源生产高活性的HpSH，本研究中使用的酶是在天然宿主内生产的。将最近鉴定出的编码其四个结构亚基HoxFUYH的基因和编码内肽酶HoxW的基因作为一个人工操纵子进行表达。使用了Grenz等人使用的pOCEx1质粒。通过Gibson组装将具有人工核糖体结合位点（RBS）和间隔区的各个基因组合起来，构建pOCEx1-StrepII-hoxFUYH，详情见补充材料。随后，将质粒转化并在大肠杆菌S17-1中扩增。为了生产HpSH，将先前构建的质粒根据Grenz等人的方法接合到嗜氢假单胞菌DSM 1084中，从而获得生产菌株。
酶的表达与纯化
为了生产HpSH，使用先前构建的生产菌株接种含有25 μg mL–1卡那霉素的TB琼脂平板。在30 °C生长3天后，从该平板接种5 mL LB培养基（10 g L–1胰蛋白胨，5 g L–1酵母提取物，25 μg mL–1卡那霉素）的预培养物，在30 °C、120 rpm摇床培养8小时。随后用此培养物接种第二个预培养物（50 mL，含1%果糖、25 μg mL–1卡那霉素和10 g L–1MOPS的CO-Ox培养基）。然后用第二个预培养物接种主培养物，主培养物含有相同培养基并添加了1 mM IPTG。本研究使用的CO-Ox培养基遵循DSMZ指定的配方，根据先前的研究，包含1%果糖和10 g L–1MOPS。细胞生长至600 nm光密度（OD600）达到4。随后，通过在4 °C、4,000 × g离心收集细胞，用缓冲液（50 mM Tris-HCl和150 mM KCl，pH 7
