基于流式细胞术与颗粒平衡法揭示嗜热四膜虫对微塑料的动态摄取与消除机制

《Environment & Health》：Dynamic Uptake and Elimination of Microplastics by Tetrahymena thermophila

本研究开发了一种结合颗粒平衡法（PB）和生物动力学模型的高通量流式细胞术策略，首次在单细胞水平上定量揭示了嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）对微塑料（MPs）的动态摄取与消除过程。研究发现，细胞分裂（生长稀释）对降低细胞内MPs负荷的贡献是主动消除的3.6至5.8倍，且计算出的生物浓缩因子（BCF）超过4800，表明MPs在基础水生生物中具有极高的生物累积潜力，为评估MPs的生态风险提供了关键的技术支持和机制见解。

　　

文章内容归纳总结

引言

微塑料（MPs）作为一种新兴的环境污染物，其在水生生态系统中的归趋及对食物网基础生物的影响是评估其毒性和环境风险的关键。嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）作为淡水生态系统中广泛存在的纤毛类原生动物，是水生食物网的重要环节，常被用作环境毒性评估的模型生物。尽管已有研究表明T. thermophila能够摄取和积累MPs，但利用高通量方法在单细胞水平上对MPs的绝对细胞摄取量进行分析仍面临挑战。传统的荧光显微镜等方法通量低，且荧光强度易受染料淬灭、细胞背景噪声等因素干扰，难以建立荧光强度与内化颗粒数之间的可靠校准关系。因此，开发一种能够准确定量MPs在T. thermophila中摄取和消除动力学的方法，对于理解MPs进入食物链的初始过程至关重要。

材料与方法

本研究采用2 μm的Cy5标记聚苯乙烯微球作为模型MPs，以T. thermophila为受试生物。研究首先对MPs的形貌、粒径、Zeta电位及荧光稳定性进行了表征。细胞培养及暴露实验在标准条件下进行，分别设置了增殖实验（0-1000 μg/mL，24 h）和动力学实验（0-100 μg/mL，0.5-24 h）。

流式细胞术分析与颗粒平衡法

流式细胞术是本研究的关键分析工具。研究人员利用细胞与MPs在大小上的显著差异（细胞20-40 μm，MPs 2 μm），通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数成功区分了细胞群体和细胞外MPs群体。为了准确定量细胞内MPs的数量，本研究开发并比较了三种方法：

1. 1.
   荧光峰高法（FL-H）：通过细胞荧光峰高与单个MPs荧光峰高的比值计算。
2. 2.
   荧光面积法（FL-A）：通过细胞荧光面积与单个MPs荧光面积的比值计算。
3. 3.
   颗粒平衡法（PB）：这是本研究提出的核心方法。该方法基于质量守恒原理，通过计算暴露体系中MPs的总量减去细胞外MPs的量，再除以细胞总数，得到每个细胞内的MPs数量。该方法不依赖于荧光信号的线性关系，有效避免了荧光淬灭和背景干扰。

生物动力学模型

为了深入理解MPs在T. thermophila中的动态行为，本研究建立了一个生物动力学模型。该模型基于一级动力学方程，描述了MPs的摄取和消除过程。其中，消除速率常数（k₂）被分解为两个部分：真实的消除速率常数（k_e）和生长稀释速率常数（μ）。通过该模型，可以计算出摄取速率常数（k₁）、消除速率常数（k₂）以及生物浓缩因子（BCF = k₁/k₂）。

结果与讨论

1. MPs表征与稳定性

表征结果显示，所用MPs呈球形，平均粒径为2.02 ± 0.13 μm，在不同介质中均表现出良好的胶体稳定性。荧光光谱分析表明，Cy5染料标记牢固，在24小时内荧光强度稳定，染料泄漏率低于0.7%，确保了后续实验结果的可靠性。

2. 流式细胞术检测与定量

增殖实验表明，MPs对T. thermophila的生长具有剂量依赖性抑制作用，在500和1000 μg/mL浓度下，细胞密度分别下降了10.68%和20.23%。在动力学实验中，研究人员发现，在暴露初期（1小时内），细胞内MPs数量迅速增加；然而，随着暴露时间的延长（24小时内），细胞内MPs数量显著下降，表明存在清除机制。

在定量方法比较中，FL-A法计算出的细胞内颗粒数远高于FL-H法和PB法。通过分析发现，大颗粒或细胞内聚集的MPs会导致流式细胞术检测中的脉冲宽度（Pulse Width）增加，从而导致FL-A法高估颗粒数量。相比之下，FL-H法和PB法得出的结果更为一致和可靠。因此，本研究采用PB法作为后续分析的定量依据。

3. 共聚焦显微镜验证

共聚焦显微镜观察结果与流式细胞术数据高度吻合。图像显示，MPs被T. thermophila通过口器摄取，并逐渐向胞肛转移，最终被排出体外。虽然共聚焦显微镜直接计数的颗粒数低于PB法，但两者揭示的“先摄取后清除”的动态趋势完全一致，验证了PB法的有效性。

4. MPs的动态摄取与消除

生物动力学模型拟合结果显示，MPs在T. thermophila中的摄取和消除均遵循一级动力学。随着暴露浓度的增加，摄取速率常数（k₁）和真实消除速率常数（k_e）均有所增加，表明细胞在高浓度暴露下，不仅摄取效率提高，主动排出的能力也增强了。

然而，最关键的发现在于对消除机制的解析。模型计算显示，在消除速率常数（k₂）中，生长稀释速率常数（μ）的贡献远大于真实消除速率常数（k_e）。具体而言，μ/k_e的比值在3.6至5.8之间，这意味着细胞分裂（生长稀释）对降低细胞内MPs负荷的贡献是主动消除的3.6至5.8倍。这表明，T. thermophila主要通过快速增殖来“稀释”体内的MPs，而非通过高效的主动排泄来清除它们。

5. 生物累积潜力评估

基于动力学参数计算出的生物浓缩因子（BCF）在所有暴露浓度下均超过4800，表明MPs在T. thermophila中具有极高的生物累积潜力。这一高BCF值主要归因于极高的摄取速率（k₁）和以生长稀释为主导的缓慢消除过程。

结论

本研究建立了一种基于流式细胞术和颗粒平衡法（PB）的高通量定量策略，成功揭示了T. thermophila对MPs的动态摄取与消除过程。研究发现，T. thermophila主要通过细胞分裂（生长稀释）而非主动排泄来降低其体内的MPs负荷。尽管这种机制在个体水平上可能缓解了MPs的毒性，但它同时促进了MPs通过生物量增殖在水生食物网中的传播。计算出的高生物浓缩因子（BCF > 4800）进一步证实了MPs在基础水生生物中的高累积风险。这些发现为理解MPs进入水生食物链的初始过程提供了关键的机制见解，并为评估MPs的生态风险提供了重要的技术支持和科学依据。