《Environment & Health》：Imbalance of the Arachidonic Acid Metabolism in Neuroinflammation and Cognition Caused by Manganese Exposure: Downregulation of 15d-PGJ2 Levels and Validation of MMP9 as a Target
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本研究揭示了锰（Mn）暴露导致认知功能障碍的新机制：通过破坏花生四烯酸（AA）代谢平衡，特别是下调具有强抗炎作用的内源性PPARγ配体15-脱氧-Δ12,1?-前列腺素J2（15d-PGJ2）水平，进而激活基质金属蛋白酶9（MMP9）驱动神经炎症。结合人群流行病学与实验模型，首次验证MMP9作为关键靶点，为锰神经毒性干预提供了新策略。
1. 引言
认知功能障碍是阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等神经退行性疾病的典型特征，已成为日益严重的全球健康挑战。神经炎症被广泛认为是导致认知缺陷的重要因素。环境因素可引发一系列神经炎症反应，加剧病理进程并损害认知功能。锰（Mn）是多种神经系统疾病的环境致病因素，其在缺乏和过度暴露时均与不良健康结局相关。锰能够穿过血脑屏障并累积于基底节、额叶皮层和小脑，引起多巴胺能神经元损伤。长期暴露会增加脑内锰水平。神经炎症被认为是锰诱导神经毒性的潜在机制，其中小胶质细胞激活和促炎介质分泌起着重要作用。流行病学调查显示，无论是职业暴露人群还是一般人群，锰暴露均与神经毒性和认知障碍风险升高相关。
花生四烯酸（AA）是神经膜中的一种多不饱和脂肪酸，在神经炎症信号传导中扮演重要角色。例如，AA通过环氧合酶（COX）途径产生前列腺素E2（PGE2），后者可刺激炎症反应、激活小胶质细胞并促进突触可塑性。AA代谢在调控中枢神经系统主要免疫细胞——小胶质细胞的活性方面起主要作用。前列腺素D2（PGD2）的产生和小胶质细胞激活与神经功能缺损中的神经炎症和神经退行性变相关。关键的是，AA代谢物影响认知功能：动物研究表明抑制PGE2受体可恢复记忆缺陷。PGE2和其他AA代谢物已被证明可通过调节氧化应激和神经炎症来增强老年大鼠的认知功能并减少神经退行性病变。此外，AA代谢通路异常与AD和PD等神经退行性疾病的发展密切相关，这表明调节AA代谢可能提供新的治疗途径。
尽管锰神经毒性和AA代谢失调均独立地与认知障碍相关，但它们之间的机制性相互作用尚未被探索。本研究主要目的是探讨锰诱导的AA代谢异常影响认知功能和神经炎症的可能机制，强调AA在这些疾病病理生理学中的关键作用。
2. 材料与方法
2.1. 研究人群与样本收集
本研究招募了广西崇左某锰矿厂的工人进行横断面研究。为进行比较研究，选择同一工作单位但很少直接接触锰矿石的工人作为对照组。样本纳入标准包括：在职工作两年或以上；自愿签署知情同意书；无听力或视力障碍；无神经系统疾病或精神障碍；无严重心血管或呼吸系统疾病史。使用G*Power软件（版本3.1）进行先验样本量计算，最终共纳入171名参与者，包括暴露组65人和对照组106人。所有样本均按标准程序处理、冻存和运输。研究方案经首都医科大学伦理委员会审查批准。
2.2. 尿锰浓度测量与认知功能评估
使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测量尿锰浓度。采用蒙特利尔认知评估（MoCA）中文版作为有效可靠的筛查工具来评估整体认知功能。
2.3-2.14. 其他实验方法
包括多重免疫检测、实时荧光定量PCR、动物实验设计、行为学实验（Y迷宫）、免疫荧光、RNA测序、超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）、潜在靶点获取分析、酶联免疫吸附试验（ELISA）、细胞培养与处理以及统计分析方法。
3. 结果
3.1. 锰暴露与工人神经炎症和认知障碍的关联
研究对象包括65名锰暴露工人和106名对照组。除教育水平分布存在差异外，两组在年龄、性别等其他基线特征上无显著差异。暴露组尿锰浓度显著高于对照组。MoCA评估显示，暴露组在总分及多个认知领域得分显著较低。限制性立方样条分析显示了尿锰与这些认知损害之间的线性关系。多元线性回归分析在调整潜在混杂因素后，证实MoCA评分与锰暴露呈负相关。
对血清生物标志物的检测发现，暴露组干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）水平和白细胞计数均显著升高。回归分析进一步确定了尿锰与特定生物标志物（如IL-1β、TNF-α等）的正相关关系，而这些生物标志物又与认知评分负相关。中介分析表明TNF-α在锰暴露与延迟回忆和总分之间的关联中起中介作用。
3.2. 锰暴露损害认知功能并破坏AA代谢，导致15d-PGJ2水平降低
小鼠Y迷宫测试显示，锰暴露组自发交替百分比显著降低，表明空间工作记忆受损。免疫荧光分析显示纹状体中小胶质细胞激活，表现为诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性细胞增加而精氨酸酶1（Arg1）阳性细胞减少。RNA测序和加权基因共表达网络分析（WGCNA）发现，与锰暴露最相关的基因模块显著富集于脂肪酸代谢过程、神经炎症反应和小胶质细胞激活等通路。靶向脂质组学分析证实，纹状体中AA代谢来源的特异性促消退介质15d-PGJ2水平在暴露组显著降低。通路分析表明锰暴露广泛扰动了AA代谢、亚油酸代谢等通路。联合通路分析进一步确认AA代谢通路是受锰暴露影响最显著的信号网络之一。
在人群验证中，锰暴露工人AA代谢关键基因（PTGS2、ALOX15、ALOX5）表达显著上调，而GPX4表达下调。最重要的是，暴露组血清15d-PGJ2水平显著低于对照组。这些结果共同表明锰暴露可能通过干扰PTGS2、ALOX15等基因及相关代谢物水平来影响AA代谢。
3.3. MMP9被确定为锰诱导神经炎症和认知障碍中15d-PGJ2的潜在靶点
通过生物信息学分析和分子对接，提名MMP9为潜在核心靶点，并预测15d-PGJ2与MMP9蛋白之间存在稳定结合。在锰暴露小鼠纹状体中Mmp9表达上调。同时，在工人中发现血清MMP9水平与认知功能呈负相关，提示MMP9上调与认知障碍相关。
3.4. 锰通过AA代谢途径诱导小胶质细胞炎症
在BV2小胶质细胞中，锰暴露促进了促炎状态，升高了细胞内活性氧（ROS）水平，并上调了Mmp9。锰还显著改变了AA代谢关键基因的表达。使用COX-2抑制剂NS-398预处理可减轻锰诱导的小胶质细胞炎症，使AA代谢相关基因表达正常化，减少氧化应激，并抑制锰诱导的Mmp9 mRNA上调。
3.5. 15d-PGJ2通过抑制MMP9对锰诱导的神经毒性起保护作用
15d-PGJ2处理能显著减轻锰暴露BV2小胶质细胞中的炎症因子失衡和过量ROS产生，并有效抑制锰诱导的Mmp9升高。通过小干扰RNA（siRNA）敲低Mmp9后，显著减弱了锰暴露诱导的炎症反应和氧化应激，其保护作用与15d-PGJ2的作用模式一致。这些发现证明15d-PGJ2通过靶向Mmp9来减轻锰诱导的神经炎症和氧化应激，并确立了Mmp9是锰介导神经毒性的关键下游效应分子。
4. 讨论
本横断面研究发现锰暴露工人存在多维认知障碍，且与尿锰水平显著相关。炎症是导致认知障碍的分子机制之一，神经炎症是锰诱导神经毒性的重要作用机制。锰暴露工人外周炎症标志物和神经损伤标志物发生显著改变，且这些外周生物标志物与尿锰和认知表现均相关，这与先前研究一致。中介分析强调了TNF-α在锰相关认知障碍中的关键中介作用。
在锰暴露小鼠模型中，观察到Y迷宫行为学缺陷以及小胶质细胞激活。纹状体转录组分析和靶向脂质组学揭示了AA代谢通路中的差异表达基因和代谢物，特别是抗炎代谢物15d-PGJ2的下调。15d-PGJ2已知能通过激活PPARγ和抑制核因子κB（NF-κB）来减轻神经炎症和小胶质细胞激活。
在锰暴露人群中，AA代谢相关关键mRNA表达失调，血清15d-PGJ2水平显著降低，与动物结果一致。通过生物信息学数据库联合分析、动物模型转录组谱结果和分子对接，确定MMP9是锰诱导神经炎症和认知障碍的潜在介质。MMP9作为突触重塑和神经炎症的关键介质，其水平与认知功能密切相关。
在BV2小胶质细胞中，锰暴露诱导了炎症激活，改变了AA代谢基因表达，并上调了Mmp9。COX-2是AA代谢中的关键限速酶。用COX-2抑制剂NS-398处理BV2细胞减轻了锰诱导的炎症并下调了Mmp9，这表明AA代谢通过Mmp9参与锰诱导的神经炎症。Mmp9敲低实验证实了其在神经炎症和氧化应激中的功能作用。
研究进一步证明15d-PGJ2能抑制锰诱导的BV2细胞神经炎症，减少炎症基因表达、Mmp9分泌和ROS。15d-PGJ2可能通过下调Mmp9发挥其保护作用。
本研究确立了MMP9在锰诱导神经炎症和认知障碍中的核心效应器地位，表明15d-PGJ2通过抑制MMP9和恢复氧化还原及代谢稳态来减轻锰神经毒性。这些发现阐明了AA代谢紊乱在锰神经毒性中的作用，并突出了15d-PGJ2–MMP9轴作为潜在治疗靶点。
研究也存在一些局限性，包括横断面设计的因果推断限制、15d-PGJ2在体内逆转认知行为缺陷的效果有待验证，以及AA代谢网络与炎症信号之间复杂的相互作用需进一步研究。
5. 结论
这项整合了人群与实验的研究揭示了锰诱导认知障碍的关键通路，指出神经炎症和AA代谢紊乱是其机制的核心组成部分。数据表明锰暴露与暴露工人和小鼠模型中内源性抗炎介质15d-PGJ2水平降低相关。这种下调似乎破坏了稳态平衡，导致小胶质细胞激活、向促炎脂质介质的转变以及随后的认知障碍。此外，研究确定MMP9是这一过程中功能活跃的参与者。总之，这些发现表明15d-PGJ2缺乏和AA代谢失调是锰神经毒性的重要机制。该研究不仅增进了对锰相关认知障碍机制的理解，而且突出了15d-PGJ2和MMP9作为未来治疗策略的潜在靶点。
