《Journal of Medicinal Chemistry》：Design, Synthesis, and Characterization of Novel, Subtype-Selective Fluorescent Antagonists Targeting the Nociceptin/Orphanin FQ Opioid Peptide Receptor
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本文报道了首个高亲和力小分子NOPr靶向荧光配体的开发，该研究基于拮抗剂C24进行结构优化，获得了对NOPr具有优异选择性（相较于MOPr、DOPr、KOPr）的荧光探针（如13h，KD= 5.6 nM）。这些工具分子成功应用于竞争结合实验评估配体亲和力及活细胞成像可视化受体表达，为研究NOPr药理学及其在疼痛、成瘾、帕金森病等疾病中的作用提供了关键手段。
引言
痛敏肽/孤啡肽阿片肽受体（NOPr）是阿片受体家族的一个非经典成员，与μ（MOPr）、κ（KOPr）、δ（DOPr）阿片受体具有约60%的结构同源性，并且同样属于Gi/o偶联的A类G蛋白偶联受体（GPCR）。然而，其在药理学上具有独特性：它不能结合吗啡等传统阿片生物碱或纳洛酮等广谱阿片受体拮抗剂，也不与其他阿片受体的内源性神经肽结合，而是高度选择性地与其内源性17氨基酸神经肽激动剂痛敏肽/孤啡肽FQ（N/OFQ）相互作用。NOPr在脑、脊髓及多种外周组织中广泛表达，参与调节情绪、食欲、运动、免疫细胞应答、肾脏、心血管及胃肠道活动等多种生理过程，并对伤害感受、成瘾和耐受性发展具有显著影响。因此，NOPr成为一个极具吸引力的治疗干预靶点。NOPr拮抗剂被探索用于改善帕金森病患者的运动功能及治疗抑郁症，而NOPr激动剂则在焦虑、失眠、膀胱过度活动症、疼痛以及物质使用障碍（如阻断可卡因、酒精和阿片类药物的奖赏效应）方面显示出潜力。特别是，开发同时靶向MOPr和NOPr的双重激动剂（如处于III期临床试验的cebranopadol）已成为一种有前景的策略，旨在提供强效镇痛的同时减轻MOPr选择性镇痛药带来的副作用。然而，与经典阿片受体相比，对NOPr药理学的理解仍不够全面，且缺乏高选择性的NOPr药理学工具，这阻碍了针对该受体新配体的发现进程。
结果与讨论
设计策略
研究策略始于分析先导化合物C24与NOPr的共晶结构（PDB ID: 4EA3）。结构分析揭示了C24与NOPr结合的三个关键相互作用：核心的螺[异苯并呋喃-1,4'-哌啶]支架深入结合位点，其异苯并呋喃环系统与Y1313.33形成π-堆积作用，并与M1343.36产生疏水相互作用；碱性哌啶部分与D1303.32形成盐桥，该作用对亲和力至关重要（D130A突变显著降低C24结合亲和力）；Q1072.60在Y3097.43的稳定下，与吡咯烷甲酰胺形成重要的氢键。此外，d-脯氨酸残基的引入对NOPr的高亲和力也至关重要。基于此，研究团队合理地将d-脯氨酸氨基或C24分子中的N-苄基作为连接 linker 和荧光染料的合适位点。研究合成了八种带有N-Boc保护连接子的C24类似物（11a-h）及其相应的荧光配体（13a-h和14h），旨在探索连接子长度（如α-丙氨酰、β-丙氨酰、丙基、丁基）以及苯环修饰（间位、对位取代）对活性的影响。
N-BOC-Protected-C24类似物（11a-h）及其荧光配体（13g-h和14h）在G蛋白激活 assay 中的表征
在测量NOPr激活Gαi2蛋白的BRET（生物发光共振能量转移）实验中，评估了类似物11a-h的功能活性。所有测试配体均未表现出功能性激动活性，但均能有效拮抗N/OFQ（EC80浓度）的作用，显示出拮抗剂特性。抑制 potency（pIC50）数据显示出清晰的构效关系（SAR）：增加连接子链长（11a-d）会提高抑制 potency，但保留C24的苯环对驱动拮抗剂亲和力至关重要（11e-h的 potency 显著高于11a-d）。在苯环修饰的类似物中，对位取代（11f, 11h）的抑制 potency 高于相应的间位类似物（11e, 11g）。然而，在与远红外荧光染料Sulfo-Cy5（13g-h）或BODIPY 630/650-X（14h）缀合后，这种SAR差异减弱，所有荧光配体的相对抑制 potency 处于相近范围（109-126 nM）。
全细胞成像研究表征荧光配体（13a-h和14h）与NOPr的结合
通过共聚焦显微镜观察活体FlpIn CHO细胞（稳定表达SNAP-NOPr）与荧光配体（1 μM）的结合情况。结果显示，荧光配体的结合情况与GPA assay中确定的类似物SAR一致。含有苯环结构的配体13e-h显示出明显的结合，其中13g和13h的结合最为显著，且与SNAP-AF488标记的NOPr信号高度共定位。加入未标记的NOPr拮抗剂SB-612111（1 μM）可完全置换13e-h的结合，证实了其与NOPr正构结合位点的特异性结合。相比之下，带有BODIPY荧光团的14h显示出显著的非特异性标记，无法被SB-612111置换，这可能是由于BODIPY染料的高脂溶性导致其在细胞膜中非特异性积累。因此，选择13g和13h进行进一步的药理学表征。
使用时间分辨荧光共振能量转移进行亲和力和动力学测定
利用TR-FRET结合实验定量分析了13g-h在NOPr上的亲和力和结合动力学。饱和结合实验表明，13h的亲和力（KD= 5.6 nM）比13g（KD= 19.1 nM）高约5倍，这与类似物SAR研究结果一致，表明对位修饰优于间位修饰。动力学结合实验显示，亲和力差异主要由结合速率（Kon）驱动，13h的Kon比13g快7.7倍以上，而两者的解离速率（Koff）相似，导致受体-配体停留时间约为10分钟。动力学推导的KD值与饱和结合实验确定的值高度一致。
荧光配体13g-h选择性评估
TR-FRET饱和结合实验评估了13g-h across阿片受体家族的选择性。在高达2 μM的浓度下，13g-h仅对NOPr表现出可饱和的高亲和力结合，而对MOPr、DOPr和KOPr未检测到可测量的特异性结合，显示出优异的NOPr选择性。作为对照，一种纳曲酮基础的远红色荧光配体（opioid red）在MOPr、DOPr和KOPr上显示出纳摩尔级的亲和力，但对NOPr无亲和力。
使用荧光配体13g-h作为示踪剂的TR-FRET竞争结合实验
使用13g和13h作为荧光示踪剂，通过TR-FRET竞争结合实验测定了多种未标记NOPr配体的亲和力（Ki）。拮抗剂（C24, SB-612111）和部分激动剂（AT-121, 丁丙诺啡）表现出的亲和力与文献值一致或更高。然而，完全激动剂N/OFQ的表观亲和力比先前报道值低约100倍。这种差异可能归因于实验条件的不同：本研究使用拮抗剂示踪剂，并在含有140 mM Na+离子和100 μM Gpp(NH)p的缓冲液中进行，这些条件有利于检测G蛋白解偶联的低亲和力状态下的N/OFQ结合。
在存在和不存在钠离子及鸟嘌呤核苷酸条件下使用荧光配体13H进行的TR-FRET饱和和竞争结合实验
为了进一步研究Na+和鸟嘌呤核苷酸对结合的影响，研究比较了在含Na+/Gpp(NH)p和不含Na+（用NMDG替代）的缓冲液中13h的饱和结合以及竞争结合实验。结果表明，Na+和Gpp(NH)p的存在使激动剂（N/OFQ, MCOPPB）的表观亲和力降低了约16倍，而对拮抗剂（SB-612111）的亲和力影响很小。这凸显了示踪剂选择和实验条件对于准确测定配体亲和力，特别是在评估跨受体亚型选择性时的重要性。
荧光显微镜测定13g-h的阿片受体选择性
在瞬时转染了SNAP标记的hNOPr、hMOPr、hDOPr或hKOPr的HEK 293T细胞中，使用13g（400 nM）和13h（100 nM）进行成像实验。结果显示，13g和13h能特异性标记NOPr，而对MOPr、DOPr和KOPr则未观察到明显的特异性结合。通过定量分析荧光强度/细胞，证实了13g-h对NOPr的高度选择性。
结论
本研究成功设计、合成并药理学表征了一个基于高亲和力NOPr拮抗剂C24的小分子荧光配体库。其中，荧光配体13g和13h表现出纳摩尔级的亲和力、优异的NOPr选择性以及适于结合研究的动力学特性。它们可作为TR-FRET竞争结合实验中的示踪剂，用于测量未标记NOPr配体的亲和力和结合动力学，并能在活细胞成像中选择性标记NOPr，为研究该受体的表达分布和药理学提供了宝贵的工具。
实验部分
详细描述了目标化合物的合成路线、纯化方法及结构确证数据（NMR, HRMS）。药理学实验部分包括：稳定表达SNAP-NOPr的Flp-In CHO细胞系的构建；用于评估功能活性的BRET G蛋白激活实验方案；活细胞共聚焦显微镜成像的具体步骤和条件；以及TR-FRET结合实验（饱和、动力学、竞争结合）的详细操作流程和数据分析方法。所有实验均遵循标准操作规程，确保数据的可靠性和可重复性。
