《Precision Chemistry》：Controllable Preparation and Performance Investigation of Amino Acid Functionalized Mixed-Mode Chromatographic Stationary Phase
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本文开发了基于肽接枝和超支化聚合的可控制备策略，成功构建了多种氨基酸（Ala、Lys、Tyr）功能化混合模式色谱（MMC）固定相。研究证实，氨基酸单体的选择与接枝策略共同决定了固定相的表面结构与分离性能。其中，赖氨酸（Lys）基材料因其丰富的分子间相互作用展现出优异的综合分离能力，而超支化修饰策略则通过构建三维网络结构显著提升了空间选择性，在硝基苯酚异构体分离及实际水样分析中表现出高准确度与可靠性。
引言
混合模式液相色谱（MMC）作为一种先进的分离技术，通过在同一色谱系统中集成多种保留机制，显著提高了对复杂混合物的分离选择性和效率。氨基酸和肽作为天然的两性离子化合物，其分子结构中富含亲水、疏水及离子交换位点，是构建MMC固定相的理想功能单元。然而，目前关于肽修饰固定相的结构控制研究仍较为有限，主要受限于缺乏简单、高效且可控的肽接枝策略。此外，如何精确调控固定相的表面结构和色谱性能，仍是当前研究面临的挑战。
本研究旨在开发两种新型氨基酸功能化MMC固定相的可控制备策略，即肽接枝固定相（PGSP）和氨基酸超支化固定相（HBSP）。通过选择不同性质的氨基酸单体（非极性的丙氨酸Ala、极性的赖氨酸Lys、芳香族的酪氨酸Tyr），并结合干湿循环肽形成反应和1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）交联反应，系统研究了氨基酸类型和接枝策略对固定相结构及色谱性能的影响，为构建结构可调、性能优异的MMC材料提供了理论依据和设计平台。
实验部分
试剂与材料
实验所用聚苯乙烯-二乙烯基苯-甲基丙烯酸缩水甘油酯（PS-GMA）微球（粒径5 μm）根据前期工作合成。丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）及氢氧化钠（NaOH）购自阿拉丁化学有限公司。1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）和三偏磷酸钠（P3m）购自麦克林生化科技有限公司。高效液相色谱（HPLC）分析所用甲醇和乙腈（ACN）为色谱纯，购自阿达玛斯试剂有限公司。实际样品测定所用河水取自浙江省宁波市甬江。
肽接枝固定相（PGSPs）的合成
肽接枝固定相通过干湿循环肽形成反应合成。首先，将PS-GMA微球与Ala分散于乙醇/水混合液中，在80°C水浴中反应10小时，经洗涤干燥得到PS-GMA-Ala。随后，将PS-GMA-Ala、Ala和P3m加入90%乙醇水溶液中，用1 M NaOH调节pH至9，在80°C下搅拌蒸发溶剂完成一次干湿循环反应。重复此操作，分别通过2次、4次和6次循环反应制备得到Ala-2C-PGSP、Ala-4C-PGSP和Ala-6C-PGSP。类似地，将Ala替换为Lys和Tyr，分别通过6次循环反应制备Lys-6C-PGSP和Tyr-6C-PGSP。
氨基酸超支化固定相（HBSPs）的合成
氨基酸超支化固定相通过氨基酸与BDDE的交联反应合成。首先，采用与PGSP合成相同的方法将第一个Ala接枝到PS-GMA表面，得到PS-GMA-Ala。随后，将合成的PS-GMA-Ala与BDDE分散于60%甲醇水溶液中，用1 M NaOH调节pH至9，在氮气保护下于80°C反应3小时，得到接枝一层Ala超支化聚合物的固定相。重复上述两步操作，分别制备得到接枝3层和4层Ala超支化聚合物的固定相，命名为Ala-3L-HBSP和Ala-4L-HBSP。类似地，将Ala替换为Lys和Tyr，分别通过4层接枝制备Lys-4L-HBSP和Tyr-4L-HBSP。
结果与讨论
固定相的表征
通过调节干湿循环次数或超支化接枝层数，可以精确调控固定相表面功能基团的接枝密度。基于初步色谱评估，选择反应6次的PGSP和接枝4层的HBSP进行深入研究。
扫描电子显微镜（SEM）表征结果显示，原始PS-GMA微球为单分散颗粒，平均粒径为5 μm。经过6次干湿循环肽形成反应或4层超支化接枝反应后，PS-GMA微球的形貌基本保持不变，表明两种修饰方法对颗粒尺寸和形貌影响较小。
N2吸附-脱附测试结果表明，与未修饰的PS-GMA相比，功能化材料的比表面积和孔体积均显著降低，证实了肽和超支化聚合物的成功接枝。值得注意的是，Lys-4L-HBSP的孔径有所增加，这归因于超支化修饰诱导形成了互穿网络结构。
傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，PS-GMA在2940 cm–1处出现C-H伸缩振动吸收峰，在1607 cm–1和3457 cm–1处分别出现酰胺键振动和O-H伸缩吸收峰。在PGSPs和HBSPs中，这些峰的强度显著增强，表明肽和氨基酸基超支化聚合物已成功接枝。
元素分析定量评估了氨基酸的接枝效率。由于原始PS-GMA不含氮，改性固定相中的氮含量全部来自接枝的氨基酸。计算结果表明，Ala-6C-PGSP、Lys-6C-PGSP和Tyr-6C-PGSP的氨基酸接枝量分别为88.67、26.68和45.81 μmol g–1，表明非极性和芳香族氨基酸的接枝效率显著高于极性类似物。HBSPs中升高的氮含量也直接证明了超支化聚合物的成功引入，但由于BDDE交联剂的存在，其氨基酸接枝量（Ala-4L-HBSP: 16.84 μmol g–1, Lys-4L-HBSP: 17.44 μmol g–1, Tyr-4L-HBSP: 9.93 μmol g–1）低于PGSPs。
疏水性和亲水性化合物保留行为的表征
为了评估所制备固定相的MMC性能，选择五种烷基苯和六种核苷/核苷碱基作为模型分析物。在Ala-6C-PGSP和Lys-4L-HBSP色谱柱上，所有五种烷基苯均得到有效分离。保留时间随Log P值的增加而增加，符合反相保留机制。与未修饰的PS-GMA相比，两种功能化色谱柱对烷基苯的保留时间均显著缩短，表明接枝的肽或超支化聚合物屏蔽了PS-GMA微球的疏水表面，从而削弱了疏水相互作用。
亲水性分离能力评估结果显示，与裸PS-GMA相比，两种改性固定相对核苷/核苷碱基的保留时间显著延长，分辨率提高，表明接枝的功能层在促进亲水相互作用中起着关键作用。然而，核苷/核苷碱基的洗脱顺序与其Log P值不相关，暗示了多模式保留机制（如极性和离子相互作用）的参与。
进一步考察了流动相中有机溶剂比例和缓冲盐浓度对保留行为的影响。烷基苯的保留因子随ACN含量的增加而减小，符合常规反相液相色谱（RPLC）机制。而核苷/核苷碱基的保留则随ACN比例的增加呈现U型趋势：在低ACN水平（1–10%）下，Log k随ACN含量增加而减小，反映RPLC模式行为；在高ACN含量（80–99%）下，Log k随ACN比例增加而增加，表明亲水相互作用液相色谱（HILIC）保留。这些结果证实了固定相的混合模式保留机制。当ACN固定为98%时，缓冲液浓度对色谱行为的影响较小，表明在此条件下离子相互作用不是核苷/核苷碱基保留的主要因素。
稳定性和重现性考察
在RPLC模式下连续进样100次，评估了Ala-6C-PGSP和Lys-4L-HBSP色谱柱的重现性和稳定性。Ala-6C-PGSP色谱柱的保留时间、峰面积、峰高和半峰宽（fwhm）的相对标准偏差（RSD）分别为0.21–0.42%、0.35–5.72%、0.43–2.68%和0.35–3.14%。Lys-4L-HBSP色谱柱的相应RSD值分别为0.05–0.09%、0.79–0.93%、0.88–1.04%和0.14–0.65%。此外，在HILIC条件下连续进样100次，Ala-6C-PGSP色谱柱保留时间的RSD为0.39%至2.96%，Lys-4L-HBSP色谱柱为0.37%至0.83%。这些结果表明，两种方法制备的混合模式固定相均表现出优异的稳定性。
氨基酸和接枝方法对色谱柱分离性能的影响
氨基酸单体的选择和接枝策略显著影响了合成MMC固定相的接枝效率和表面结构，从而导致不同的色谱保留行为。具体而言，引入的氨基酸类型决定了可用的分子间相互作用，而接枝方法则影响了功能基团密度、空间排列和传质效率。
肽接枝固定相显著缩短了烷基苯的保留时间。其中，Tyr-6C-PGSP的保留时间最短，这归因于接枝效率和侧链性质的共同作用。然而，Tyr中酚羟基的多种相互作用也导致了不均匀吸附和较差的色谱对称性。该固定相对核苷/核苷碱基的分离效率最低，主要原因是Tyr侧链与PS-GMA骨架之间存在强烈的π-π相互作用，降低了选择性。相比之下，Ala-6C-PGSP和Lys-6C-PGSP对核苷/核苷碱基的分离效果更好，但由于氨基酸-核苷相互作用的差异，其具体保留行为也有所不同。
与Tyr-6C-PGSP色谱柱相比，超支化修饰构建了复杂的三维聚合物网络，增强了多模式分子相互作用，显著改善了Tyr-4L-HBSP对烷基苯和核苷/核苷碱基的分离。该策略也提高了Ala-4L-HBSP和Lys-4L-HBSP色谱柱的性能，这得益于超支化结构提供的丰富相互作用位点。
除了烷基苯和核苷/核苷碱基，还使用各种芳香族化合物（包括取代苯、酚和苯胺）对色谱柱进行了评估。Lys-6C-PGSP色谱柱实现了最佳的综合性能，这得益于Lys单体提供的多种相互作用（如疏水、氢键和离子交换）以及其柔性线性肽结构实现的高效传质，从而在柱效、峰对称性和分辨率之间取得了良好的平衡。Tyr-6C-PGSP色谱柱对芳香族分析物表现出特殊的选择性，这得益于其酚羟基提供的氢键和π-π相互作用。相比之下，Ala功能化色谱柱由于主要依赖疏水保留机制，其性能明显较差。
总之，具有多个相互作用位点的氨基酸可以为色谱固定相提供更高的柱效和分离度。刷状多肽接枝有利于高效传质，有助于获得满意的峰形。
空间选择性与实际应用
鉴于Lys接枝固定相在分离芳香族化合物方面的优异性能，选择Lys-4L-HBSP和Lys-6C-PGSP作为模型体系，用于分离硝基苯酚异构体（NPs），以评估接枝策略和表面结构对空间选择性的影响。
所有三种NPs在Lys-4L-HBSP色谱柱上的保留更强，表明分析物与固定相之间的相互作用增强。Lys-6C-PGSP色谱柱未能分离间硝基苯酚和对硝基苯酚，这归因于有限的空间识别能力。然而，在Lys-4L-HBSP色谱柱上实现了所有三种异构体的完全基线分离。Lys-4L-HBSP增强的空间选择性归因于其三维超支化网络，该网络提供了一个空间受限的环境，有利于与异构体取代基发生差异相互作用。
为了评估Lys-4L-HBSP色谱柱的实际应用价值，将其应用于河水样品中NP污染物的分析。采用标准加入法进行定量。结果表明，所有三种异构体均表现出优异的线性（R2> 0.99），加标回收率在99.96%至108.4%之间，证实了所提出的固定相在复杂环境基质中具有高检测准确度和可靠性。三种硝基苯酚异构体的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.032–0.099 ppm和0.108–0.331 ppm，表明该方法具有高灵敏度。在所用色谱条件下未观察到明显的基质干扰，加标河水样品的高回收率和一致的峰形证明了这一点。
结论
本研究通过高度可控的制备策略（肽接枝和氨基酸超支化聚合）设计并合成了两种新型MMC固定相。以Ala、Lys和Tyr为功能单体，成功制备了一系列具有定制表面结构的固定相。这些材料有效分离了烷基苯、核苷/核苷碱基和芳香族化合物。所提出的策略通过改变肽合成循环次数或超支化接枝层数，实现了对接枝密度和空间构型的精确调控。系统研究表明，色谱性能受氨基酸单体类型和接枝方法的显著影响。结果表明，不同氨基酸提供的分子相互作用直接决定了分离行为。肽接枝产生柔性线性链，有利于传质；而超支化修饰形成三维网络，增强了立体选择性。在合成的材料中，Lys-6C-PGSP表现出优异的综合分离性能，而Tyr-6C-PGSP对芳香族化合物表现出特殊的功效。此外，Lys-4L-HBSP实现了硝基苯酚异构体的卓越分离。实际水样验证证实了其高准确度和可靠性，回收率在99.96%至108.41%之间。这些发现强调了单体选择和聚合物结构在MMC固定相合理设计中的关键重要性。所开发的功能化策略为定制保留特性和优化复杂样品分离提供了一个稳健且可控的平台。
