《International Journal of Dermatology and Venereology》：Pulsed Dye Laser Versus Photodynamic Therapy for the Treatment of Port Wine Stain: A Systematic Review and Meta-analysis
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本研究系统探讨了m6A RNA甲基化修饰在皮肤黑色素瘤（CM）中的预后价值及其与铜死亡（cuproptosis）的关联。研究构建了基于6个m6A相关基因（HNRNPA2B1、METTL3、WTAP、METTL15、YTHDC1、RBMX）的风险模型，发现低风险组患者具有更高的CD8+T细胞和M1巨噬细胞浸润水平。研究还揭示了铜死亡相关基因MTF-1、PDHB和FDX1与风险评分呈显著负相关，并通过体外实验证实YTHDF3下调可影响多个铜死亡相关基因的表达，为CM提供了新的潜在预测标志物和治疗靶点。
研究背景与目的
皮肤黑色素瘤（CM）是恶性程度最高的皮肤肿瘤，尽管免疫检查点抑制剂等治疗手段取得了一定进展，但其预后仍不理想，亟需寻找有效的预后标志物和新的治疗靶点。N6-甲基腺苷（m6A）是RNA中最常见的转录后修饰，在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。铜死亡（cuproptosis）是一种新发现的、由细胞内铜依赖性线粒体应激诱导的细胞死亡方式，与多种肿瘤的预后相关。然而，m6A修饰在黑色素瘤铜死亡过程中的作用尚不明确。本研究旨在探讨m6A相关基因在CM中的预后价值，并分析其与铜死亡相关基因的关联。
材料与方法
研究从XENA数据库获取了471例CM组织的转录组数据，并从基因型-组织表达（GTEx）数据库获取了812例正常皮肤样本数据作为训练队列。同时，从基因表达综合（GEO）数据库获取了包含210例CM患者预后信息的GSE65904数据集作为验证队列。研究分析了21个m6A相关基因（包括8个“书写器”、2个“擦除器”和11个“阅读器”）的表达差异。通过单因素Cox回归分析和LASSO回归分析构建风险模型，并利用CIBERSORT算法评估肿瘤免疫细胞浸润情况。此外，研究还分析了10个铜死亡相关基因（FDX1、LIPT1、DLD、LIAS、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、GLS、CDKN2A）在不同风险组中的表达差异，并通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和相关性分析探讨了m6A相关基因与铜死亡相关基因的潜在关系。最后，通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）在YTHDF3敲低的黑色素瘤细胞系中验证了铜死亡相关基因的表达变化。
结果
m6A相关基因的差异表达与预后分析
所有21个m6A相关基因在黑色素瘤组织和正常组织中的表达均存在显著差异。其中，WTAP、METTL3、HNRNPC、FTO、YTHDC1、YTHDC2、METTL14、RBMX、VIRMA和HNRNPA2B1在肿瘤组织中表达下调，其余基因表达上调。单因素Cox回归分析筛选出8个与预后显著相关的m6A相关基因（HNRNPA2B1、METTL14、METTL15、METTL3、RBMX、WTAP、YTHDC1和YTHDC2），这些基因的高表达与患者较长的总生存期相关。
风险模型的构建与验证
通过LASSO回归分析，研究最终筛选出6个优化的m6A相关基因（HNRNPA2B1、METTL3、WTAP、METTL15、YTHDC1和RBMX）用于构建风险模型。风险评分（RS）的计算公式为：RS = (-0.05150881) × Exp HNRNPA2B1 + (-0.12686674) × Exp METTL3 + (-0.1120262) × Exp WTAP + (0.01255647) × Exp METTL15 + (0.07389284) × Exp YTHDC1 + (0.15310919) × Exp RBMX。Kaplan-Meier生存分析显示，高风险组患者的预后显著差于低风险组患者。受试者工作特征（ROC）曲线分析表明，该风险模型在训练集和验证集中均具有良好的预测准确性（曲线下面积AUC分别为0.792和0.731）。
功能富集与免疫浸润分析
基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，不同风险组间的差异表达基因主要富集于信号转导、免疫应答、炎症反应以及细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。免疫浸润分析发现，低风险组患者肿瘤组织中CD8+T细胞、记忆活化CD4+T细胞、活化自然杀伤（NK）细胞和M1巨噬细胞的浸润水平显著高于高风险组，而记忆静息CD4+T细胞和M0巨噬细胞的浸润水平则相反。
铜死亡相关基因的表达分析
在10个铜死亡相关基因中，MTF1、PDHB和FDX1在高风险组中的表达水平显著低于低风险组，且这三个基因的表达水平与风险评分呈显著负相关。PPI网络分析揭示了m6A相关基因与铜死亡相关基因之间存在16个连接对。相关性分析发现，铜死亡相关基因GLS与m6A“擦除器”ALKBH5呈最显著的负相关，而与m6A“书写器”METTL15呈最显著的正相关。
体外实验验证
在YTHDF3敲低的黑色素瘤细胞系（A2058和A375）中，RT-qPCR检测结果显示，铜死亡相关基因MTF1、PDHB、LIAS、GLS、DLAT、DLD和PDHA1的mRNA表达水平均显著上调。
讨论与结论
本研究构建了一个基于6个m6A相关基因的风险模型，该模型能够有效预测CM患者的预后。研究发现，低风险组患者具有更有利的免疫微环境，表现为更高的抗肿瘤免疫细胞浸润水平。此外，研究首次揭示了m6A修饰与铜死亡过程在黑色素瘤中的潜在联系，发现铜死亡相关基因MTF1、PDHB和FDX1与风险评分呈负相关，且m6A“阅读器”YTHDF3的下调能够影响多个铜死亡相关基因的表达。这些发现表明，m6A修饰可能通过调控铜死亡过程参与黑色素瘤的进展，为CM提供了新的潜在预测标志物和治疗靶点。
