综述：临床类二十烷酸定量分析中GC–MS/MS与LC-MS/MS方法的批判性回顾与讨论：40年历史回顾及对LC-MS/MS的启示

《Journal of Chromatography B》：Quantitative GC–MS/MS in the clinical analysis of eicosanoids: A critical review and discussion, a 40-years historical retrospect, and possible implications for LC-MS/MS

本综述系统回顾了四十年来稳定同位素稀释气相色谱-串联质谱（GC–MS/MS）在类二十烷酸（eicosanoids）临床定量分析中的应用，并与新兴的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术进行批判性比较。文章强调GC–MS/MS在发现前列腺素（PGs）、血栓烷（Tx）、白三烯（LTs）等关键生物活性分子及其代谢通路中的历史贡献，并指出其在灵敏度（如LLOQ）和特异性方面的优势。同时，作者 critically 讨论了当前LC-MS/MS用户在实践中面临的挑战，特别是对于血栓烷B2（TxB2）和白三烯B4（LTB4）等低丰度分析物，其报告的基础浓度值与早期GC–MS/MS研究存在数量级差异，呼吁现代研究者重视前人建立的里程碑浓度数据与分析方法学经验。

　　

引言：类二十烷酸的发现之旅

类二十烷酸，这个源自希腊语“二十”的家族名称，涵盖了前列腺素（PGs）、血栓烷（Tx）和白三烯（LTs）等一系列由花生四烯酸（C₂₀H₃₂O₂）衍生而来的重要生物活性分子。上世纪50年代至70年代，Sune Bergstr?m、Bengt Samuelsson、John Vane和Elias J. Corey等科学家的开创性工作，不仅揭示了这些分子的化学结构和生物合成途径，更为他们赢得了诺贝尔奖的殊荣。质谱技术，尤其是气相色谱-质谱联用（GC–MS）技术，在这场发现之旅中扮演了主角，为后续的定量分析奠定了坚实基础。

质谱技术在类二十烷酸临床研究中的先驱角色

临床研究人员与化学分析师紧密合作，在美国和欧洲率先应用GC–MS及其进阶技术GC–MS/MS，利用稳定同位素标记类似物作为内标，定量分析临床试验中血浆、血清和尿液样本中的类二十烷酸及其代谢物。德国等地的研究中心，如J.C. Fr?lich和H.W. Seyberth的研究组，成为应用稳定同位素稀释GC–MS/MS进行定量临床分析的重要力量。

庞大的类二十烷酸家族及其代谢

类二十烷酸家族成员繁多，主要经由三条酶促通路生成：环氧化酶（COX）通路产生前列腺素和血栓烷；脂氧合酶（LO）通路产生白三烯和脂氧素；细胞色素P450（CYP）通路则产生环氧化物和羟基化代谢物，如环氧二十碳三烯酸（EETs）和羟基二十碳四烯酸（HETEs）。这些分子在调控血管张力、肾功能、血小板聚集、超敏反应和炎症等关键生理病理过程中发挥核心作用。由于许多初级类二十烷酸（如TxA₂, PGI₂）极不稳定，测量其稳定的水解产物（如TxB₂, 6-酮基-PGF_1α）或特定的指数代谢物（如2,3-去二甲基-TxB₂, 2,3-去二甲基-6-酮基-PGF_1α）成为评估体内合成的可靠策略，尤其能避免采血过程中人为假象的形成。

GC–MS和GC–MS/MS定量分析类二十烷酸的技术核心

GC–MS/MS定量分析类二十烷酸通常涉及复杂的样品前处理步骤，包括从生物样本中提取目标物和内标（常用溶剂萃取、固相萃取SPE，甚至免疫亲和色谱IAC），以及关键的衍生化反应。例如，为进行负离子化学电离（NICI）-MS/MS分析，常需将羧基酯化为五氟苄酯（PFB酯），酮基进行甲肟化（MOX），羟基进行三甲基硅烷化（TMS醚化）。这种衍生化策略能显著提高检测的灵敏度和特异性。

在GC-NICI-MS中，PFB酯衍生物会形成丰度很高的[M-PFB]^-离子，通过选择离子监测（SIM）可实现高灵敏度检测。然而，在复杂的生物基质中，SIM的特异性可能不足。GC-NICI-MS/MS通过碰撞诱导解离（CID）产生特定的子离子，并进行选择反应监测（SRM），极大地提高了定量的特异性，使得在仅1 mL尿液或5 mL血浆中准确测定pM/nM级别的内源性类二十烷酸成为可能。文章详细列出了多种重要类二十烷酸（如6-酮基-PGF_1α, TxB₂, PGE₂, LTB₄, LTE₄）在GC-NICI-MS/MS分析中常用的前体离子和产物离子质量数转换对。

临床与药理学应用实例

GC–MS/MS技术已被成功应用于众多临床和药理学研究，揭示了类二十烷酸在健康和疾病状态下的变化及其对药物的反应。例如，研究发现低剂量阿司匹林能相对选择性地抑制血小板TxA₂生成，而对系统性COX活性影响较小。特异性COX-2抑制剂（如塞来昔布）与非选择性COX抑制剂（如吲哚美辛）对肾脏和全身前列腺素合成的影响也通过测量尿液中不同的指数代谢物得以阐明。在泽尔韦格综合征（Zellweger syndrome，一种过氧化物酶体缺乏症）患儿中的研究发现，其尿液中缺乏经β-氧化产生的类二十烷酸主要代谢物，而初级类二十烷酸排泄量增高，这强有力地证明了前列腺素等在体内的β-氧化主要发生在过氧化物酶体中。此外，对异前列腺素（如8-iso-PGF_2α）作为氧化应激标志物的可靠性也通过GC–MS/MS进行了深入探讨。

LC-MS/MS的兴起与挑战：与GC–MS/MS的批判性比较

LC-MS/MS技术因其分析速度快、通量高，且通常无需GC–MS/MS所需的耗时衍生化步骤，在现代类二十烷酸分析中应用日益广泛。然而，本综述 critically 指出，对于TxB₂和LTB₄等许多类二十烷酸，LC-MS/MS似乎缺乏足够的分析灵敏度（即定量下限，LLOQ）。文献数据显示，LC-MS/MS测得的健康人血浆和尿液中某些类二十烷酸的基础浓度，比早期类二十烷酸研究者使用经过验证的、量身定制的GC–MS和GC–MS/MS分析方法所报告的结果高出几个数量级。作者认为，造成这种差异的因素包括分析灵敏度不足、未能充分考虑早期GC–MS/MS研究者积累的分析经验（如样本选择、防止采血过程中假象形成），以及对LC-MS/MS技术简便性和快速性的“盲目信任”，有时甚至省去了必要的样品纯化步骤。

对2015年至2024年间发表的LC-MS/MS临床研究文献的深入评估显示，结果好坏参半。一些研究对尿液中8-iso-PGF_2α或内源性大麻素（如anandamide, AEA）的测定结果与GC–MS/MS数据具有可比性。然而，另一些研究报道的血清或血浆中TxB₂、PGE₂、PGD₂和LTB₄的浓度则远高于GC–MS/MS的可靠范围，令人对其分析方法的有效性产生质疑。作者特别强调，在涉及类二十烷酸的“临床代谢组学”研究中，术语的使用应谨慎，对于低丰度目标物的定量，仍需依靠经过验证的特定LC-MS/MS或GC–MS/MS方法。

结论与展望

质谱技术，特别是GC–MS和GC–MS/MS，在类二十烷酸的发现、结构鉴定和定量分析中发挥了不可替代的作用，为理解其在人体生理病理和药物治疗中的作用提供了关键工具。虽然LC-MS/MS凭借其高通量等优势在许多研究领域占据主导地位，但在类二十烷酸，尤其是低丰度类二十烷酸的临床定量分析中，GC–MS/MS在灵敏度和特异性方面的优势依然明显。现代类二十烷酸研究者亟需借鉴早期研究者建立的里程碑式的浓度数据和精细的分析方法学经验。可靠的定量分析需要综合考虑非分析因素（如临床方案设计）、分析前因素（如样本采集处理）和分析因素（如方法验证、质量控制和适当的样品前处理）。GC–MS/MS和LC-MS/MS并非简单的“对手”关系，而是应根据具体分析物的特性和研究目的，审慎选择和应用的工具。未来，严谨的方法学验证和与已知可靠数据的比对，对于确保类二十烷酸临床定量分析结果的准确性至关重要。