《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Elucidation of ACAT1's role in hepatic ischemia-reperfusion injury: TFEB-mediated mitophagy and ferroptosis modulation as therapeutic targets
编辑推荐：
本研究针对肝缺血再灌注损伤（HIRI）的临床难题，通过单细胞转录组和乙酰化蛋白质组学技术，首次揭示线粒体乙酰转移酶ACAT1通过乙酰化修饰转录因子TFEB（K116位点），促进其核转位并激活线粒体自噬，进而抑制铁死亡的关键机制。该研究为HIRI的靶向治疗提供了新策略，发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》。
肝缺血再灌注损伤（HIRI）是肝脏手术、移植和休克等临床场景中常见的严重并发症，严重影响患者预后。尽管已有研究揭示了氧化应激、线粒体功能障碍和细胞死亡等多种病理过程参与HIRI，但其具体分子机制尚未完全阐明，缺乏有效的治疗靶点。近年来，自噬（特别是选择性清除受损线粒体的线粒体自噬）和铁死亡（一种铁依赖性的脂质过氧化驱动的新型细胞死亡方式）在HIRI中的作用逐渐受到关注，然而它们之间的调控网络和关键分子开关仍有待探索。
为了深入解析HIRI的细胞异质性和分子机制，研究人员首先构建了小鼠HIRI模型，并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对肝组织细胞进行了高分辨率分析。结果显示，与假手术组相比，HIRI模型中肝细胞数量显著减少，而内皮细胞、巨噬细胞/单核细胞和B细胞等非实质细胞增多，细胞间通讯网络发生重塑。通过对肝细胞差异表达基因的分析，并结合批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据，研究人员利用LASSO回归和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）等机器学习算法进行关键基因筛选，最终将线粒体乙酰辅酶A乙酰转移酶1（ACAT1）锁定为HIRI中的核心差异表达基因，其在HIRI组织中表达显著下调。
在机制探索层面，研究团队采用了多种关键技术。体内实验使用BALB/c小鼠构建HIRI模型，通过尾静脉注射过表达ACAT1（oe-ACAT1）或敲低TFEB（sh-TFEB）的慢病毒进行功能验证。体外实验则利用人正常肝细胞系MIHA建立缺氧/复氧（H/R）模型模拟HIRI。核心实验技术包括：单细胞RNA测序（scRNA-seq）用于揭示细胞异质性和差异基因表达；高通量转录组测序（bulk RNA-seq）用于筛选差异表达基因；定量乙酰化蛋白质组学（quantitative acetylproteomics）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术用于全面分析ACAT1过表达后的蛋白质乙酰化修饰谱；免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）和点突变实验用于验证ACAT1与TFEB的直接相互作用及关键乙酰化位点（K116）；激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜（TEM）和线粒体膜电位（JC-1）、活性氧（ROS）检测等技术用于评估线粒体形态功能、自噬流和氧化应激水平；此外，还通过TUNEL染色、流式细胞术、Western blot（WB）等方法检测细胞凋亡和铁死亡相关指标。
3.1. HIRI中肝细胞数量及相互作用失调
研究人员成功构建了小鼠HIRI模型，证实肝组织出现典型损伤特征（如ALT、AST升高）。scRNA-seq分析揭示了HIRI条件下肝细胞比例下降，细胞间通讯减弱，提示肝细胞是HIRI的主要靶细胞。
3.2. HIRI小鼠肝组织差异基因表达及功能分析
整合scRNA-seq和bulk RNA-seq数据，筛选出51个共同差异表达基因。功能富集分析显示这些基因显著富集于铁死亡、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路等。通过机器学习算法进一步筛选出6个关键基因，其中ACAT1在肝细胞中富集程度最高且与HIRI负相关。
3.3. ACAT1保护肝细胞免受H/R损伤
在MIHA细胞H/R模型中，ACAT1过表达显著提高细胞活力、减少凋亡，并调控凋亡相关蛋白（如降低BAX、caspase9、cleaved-caspase3/caspase3，升高Bcl-2），证实ACAT1具有直接的肝保护作用。
3.4. ACAT1介导的蛋白质乙酰化调控线粒体功能
乙酰化蛋白质组学分析发现，ACAT1过表达后全局蛋白质乙酰化水平升高，差异乙酰化蛋白显著富集于线粒体解体、线粒体自噬和铁死亡等通路。进一步筛选出TFEB是关键的乙酰化靶点，其K116位点乙酰化修饰高度保守。
3.5. ACAT1促进TFEB乙酰化及核转位
免疫共沉淀证实ACAT1与TFEB直接结合，并促进TFEB的乙酰化（尤其是K116位点）。点突变实验（K116R）显示该位点对TFEB乙酰化至关重要。ACAT1过表达还促进TFEB核转位，激活其下游自噬/溶酶体相关基因（如Beclin1、CTSB、LAMP1、LC3II/I升高，P62降低），并抑制其磷酸化（p-TFEB S142减少）。
3.6. ACAT1介导的乙酰化是其肝保护效应的关键
使用泛乙酰化抑制剂Anacardic Acid（AA）干预后，ACAT1过表达带来的细胞保护作用（如提高细胞活力、减少凋亡、促进TFEB核转位）被显著逆转，证明ACAT1的功能依赖于其乙酰化酶活性。
3.7. ACAT1通过TFEB介导的自噬保护肝细胞免受IRI
在H/R条件下，ACAT1过表达能修复线粒体形态（从碎片化恢复为管状），增强LC3与线粒体的共定位，降低线粒体膜电位（MMP）和ATP水平，减少线粒体钙超载，并促进P62的清除。而敲低TFEB则逆转了ACAT1的这些保护效应，证明ACAT1通过TFEB依赖性机制调控线粒体自噬。
3.8. ACAT1促进线粒体自噬并抑制HIRI诱导的铁死亡
ACAT1过表达显著降低H/R引起的总ROS和线粒体ROS（mtROS）水平，上调谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），降低丙二醛（MDA）、脂质过氧化和细胞内Fe2+水平及铁沉积。TFEB敲低则逆转了ACAT1对铁死亡的抑制作用。
3.9. ACAT1介导的线粒体自噬减轻HIRI
体内实验进一步验证：在HIRI小鼠模型中，ACAT1过表达能显著改善肝组织损伤（降低ALT、AST、caspase-3活性，减少TUNEL阳性细胞），增强自噬标志物表达和自噬流，降低ROS和铁死亡指标，而TFEB敲低则削弱了ACAT1的保护作用。
3.10. ACAT1通过增强自噬、减少ROS和铁死亡保护 against HIRI
综合体内外实验表明，ACAT1-TFEB轴通过促进线粒体自噬，清除受损线粒体，从而抑制氧化应激和铁死亡，最终缓解HIRI。
结论与讨论
本研究系统阐明了ACAT1在HIRI中的核心保护作用及分子机制。创新性地发现ACAT1作为线粒体乙酰转移酶，能够乙酰化修饰转录因子TFEB（K116位点），促进其去磷酸化和核转位，进而激活线粒体自噬相关基因表达，增强自噬流，有效清除受损线粒体，最终抑制ROS过量产生和铁死亡。该研究不仅揭示了ACAT1-TFEB-线粒体自噬轴是HIRI中连接线粒体代谢与核转录调控的关键桥梁，还为临床开发以ACAT1为靶点的HIRI治疗新策略提供了坚实的实验依据。未来研究可进一步探索ACAT1激动剂或TFEB激活剂在HIRI治疗中的潜在应用价值。
