利用RPA-CRISPR/Cas12a检测方法开发布鲁氏菌的视觉与荧光检测技术

《The FASEB Journal》：Development of Visual and Fluorescence Detection Method of Brucella by RPA-CRISPR/Cas12a Assay

布鲁氏菌（Brucella）是牲畜重要病原体，引发人畜共患病布鲁氏菌病，造成健康与经济损失。现有方法存在实验室要求高、操作复杂、成本贵及灵敏度不足等问题。本研究开发基于RPA-CRISPR/Cas12a技术的新型检测方法，靶向bcsp31基因，建立荧光及胶体金试纸条检测系统，灵敏度达1 copy/μL，30分钟内完成检测，特异性优于传统方法，与qPCR结果一致，适用于现场和临床。

　　

摘要

布鲁氏菌是畜牧业中一种重要的病原体，可引发布鲁氏菌病，这是一种人畜共通疾病，对人类和动物的健康及经济造成重大损失。目前用于检测布鲁氏菌的诊断方法包括培养、血清学检测以及PCR/qPCR，这些方法虽然有效，但存在固有的局限性。例如，这些方法需要BSL-3级实验室、专业技术人员、复杂的操作流程、昂贵的设备，并且在灵敏度和特异性方面存在问题，同时检测过程耗时较长，因此不适合大规模的流行病学筛查。因此，迫切需要开发一种快速、便携、成本低廉且具有高灵敏度和特异性的诊断方法。在本研究中，我们基于RPA-CRISPR/Cas12a技术建立了一种快速、便携、可靠且成本低廉的布鲁氏菌属鉴定方法。我们设计了针对布鲁氏菌的bcsp31基因的特异性RPA引物和crRNA序列。通过优化RPA-CRISPR/Cas12a系统的条件，进一步开发出了荧光检测法和侧向流动条（LFS）检测法。RPA-CRISPR/Cas12a-F方法的检测限（LoD）为1拷贝/μL，RPA-CRISPR/Cas12a-LFS方法的检测限为10拷贝/μL，整个检测过程耗时不到30分钟。该方法在区分布鲁氏菌与其他密切相关的病原体方面表现出优异的特异性。此外，在检测多种临床样本（血液、血清、牛奶、精液、阴道分泌物）时，RPA-CRISPR/Cas12a检测法与传统的定量实时PCR方法具有高度一致性。综上所述，这种方法成为一种有前景的布鲁氏菌检测工具，具有在野外监测和临床诊断中的广泛应用潜力。

图形摘要

布鲁氏菌病是一种人畜共通疾病，对人类和动物的健康及经济造成重大损失。然而，目前的诊断方法（包括培养、血清学检测和PCR/qPCR）存在一定的局限性。在本研究中，我们开发了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a技术的快速、便携且可靠的布鲁氏菌属鉴定方法，该方法通过荧光读数实现了1拷贝/μL的检测限（LoD）。该检测方法在区分布鲁氏菌与其他相关病原体方面表现出优异的特异性，并且在多种临床样本中的检测结果与qPCR方法高度一致，证明了其在野外监测和临床诊断中的应用价值。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

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