《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Novel Roles of GDF15 in Alleviating Renal Fibrosis: Promoting Autophagy and Lysosome Biogenesis via Inhibition of the PI3K/Akt/mTOR Pathway
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本文揭示了生长分化因子15（GDF15）在慢性肾脏病（CKD）肾间质纤维化（TIF）中的保护作用新机制。研究发现GDF15在纤维化肾脏中表达下调，其过表达可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进肾小管上皮细胞自噬和溶酶体生物发生，从而减轻细胞外基质（ECM）沉积和巨噬细胞浸润，为TIF治疗提供了新的潜在靶点。
引言
慢性肾脏病（CKD）是一个重大的全球公共卫生挑战，其患病率高达10%至16%。肾小管间质纤维化（TIF）是各种病因导致的CKD进展至终末期肾病（ESRD）的共同途径。转化生长因子-β1（TGF-β1）在TIF向ESRD的进展中起着关键作用，但直接靶向TGF-β1可能因破坏其潜在的保护作用而加剧肾损伤，因此需要将努力转向下游信号分子。生长分化因子15（GDF15），也称为巨噬细胞抑制性细胞因子-1，是TGF超家族的一员，在巨噬细胞中作为自分泌调节剂发挥作用。GDF15参与器官生长、分化、发育和细胞修复，具有抗炎、抗增殖和抗肿瘤特性。临床研究表明，CKD和其他慢性炎症性肾脏疾病患者血清GDF15水平升高，并且血清GDF15水平与肾小管间质GDF15 mRNA相关，表明肾脏中的GDF15可能有助于其在血液中的存在。GDF15是肾损伤反应的早期介质，调节炎症、细胞存活、增殖和凋亡。然而，GDF15在肾间质纤维化中的确切生物学作用仍不清楚。
材料与方法
本研究使用单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型和TGF-β1刺激的人肾小管上皮细胞（HK2）来研究GDF15在TIF中的作用和机制。动物实验使用C57BL/6J小鼠建立UUO模型，并分为假手术组、UUO组以及GDF15敲低或过表达干预组。细胞实验使用HK2细胞，通过质粒转染敲低或过表达GDF15，并使用TGF-β1诱导纤维化。研究采用了转录组测序、生物信息学分析、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学染色、免疫荧光共定位、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及透射电子显微镜等多种技术手段。
结果
GDF15表达在TIF中下调
整合TGF-β1刺激的HK2细胞的转录组测序数据和GEO数据库中的TIF相关数据集（GSE23338），发现160个显著下调的基因，其中GDF15差异表达最为显著。在TGF-β1刺激的HK2细胞中，纤维连接蛋白和胶原蛋白的mRNA和蛋白表达呈时间依赖性增加，而GDF15的mRNA和蛋白表达则下降。在CKD患者的肾组织中也观察到GDF15表达显著降低，且GDF15表达与TIF严重程度呈负相关，与血清肌酐水平呈负相关，与估算的肾小球滤过率（eGFR）呈正相关。在UUO小鼠模型中，Masson三色染色、天狼星红染色和免疫组化染色证实了明显的胶原沉积和纤维化。GDF15在UUO小鼠肾皮质和髓质中的表达均显著降低，且其受体GFRAL的表达也随输尿管梗阻时间的延长而逐渐下降。有趣的是，在TGF-β1刺激的HK2细胞上清液和UUO小鼠血清中，GDF15水平呈时间依赖性升高，提示其可能参与全身性反应。免疫荧光共定位显示，GDF15主要表达于血管紧张素II 1型受体（AGTR1）阳性的肾小管上皮细胞中，而GFRAL则主要定位于钠氯协同转运蛋白（NCC）阳性的远曲小管。
GDF15对肾纤维化的影响
在体外实验中，敲低GDF15加剧了TGF-β1刺激的HK2细胞中纤维连接蛋白和胶原I的mRNA和蛋白表达，即细胞外基质（ECM）沉积。而过表达GDF15则减少了ECM沉积。在体内UUO小鼠模型中，通过微泡介导的质粒递送技术上调肾脏GDF15表达，可减轻UUO诱导的纤维连接蛋白和胶原I表达上调，改善胶原沉积，并减少巨噬细胞浸润。相反，敲低GDF15表达则加剧了TIF和巨噬细胞浸润。
GDF15通过促进自噬和溶酶体生物合成发挥保护作用
生物信息学分析和基因集富集分析（GSEA）提示GDF15的下游靶基因显著富集于自噬和溶酶体相关通路。蛋白质印迹结果显示，敲低GDF15导致微管相关蛋白1轻链3（LC3）和Beclin1表达降低，自噬底物p62积累，表明自噬水平受到抑制。而过表达GDF15则显著增加LC3和Beclin1表达，减少p62积累，表明GDF15可诱导肾小管上皮细胞自噬。使用自噬抑制剂氯喹处理，可以逆转GDF15过表达对TGF-β1诱导的ECM沉积的改善作用，表明GDF15是通过激活自噬来减轻纤维化的。透射电镜观察发现，过表达GDF15可增加UUO小鼠肾脏中溶酶体的数量。同时，GDF15过表达上调了溶酶体新生关键转录因子TFEB的表达以及溶酶体膜蛋白Lamp1和Lamp2的转录水平。机制研究表明，GDF15过表达抑制了PI3K/Akt/mTOR通路的磷酸化，而敲低GDF15则产生相反效应。使用PI3K抑制剂LY294002处理，可增强对PI3K磷酸化的抑制，并在GDF15敲低背景下部分恢复自噬和抗纤维化效应，表明抑制PI3K磷酸化在GDF15介导的自噬和纤维化反应中起关键作用。
GDF15通过其受体GFRAL介导作用
为了确定GDF15的作用是否依赖于其经典受体GFRAL，研究者在HK2细胞中过表达GDF15的同时，使用小干扰RNA（siRNA）敲低GFRAL。结果显示，GFRAL敲低部分逆转了GDF15过表达对TGF-β1诱导的纤维化标志物（纤维连接蛋白和胶原I）的抑制作用，也减弱了GDF15对自噬相关蛋白（LC3B-II/I、Beclin1、p62）和TFEB表达的上调作用，并减少了溶酶体的形成。此外，GDF15对PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化的抑制作用也在GFRAL敲低后被逆转。这些结果表明，GDF15通过其受体GFRAL发挥抗纤维化和促进自噬的作用，并且这一过程是通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路实现的。
讨论
本研究证实GDF15在CKD患者和UUO小鼠的纤维化肾脏中表达下调，且其表达水平与肾纤维化程度呈负相关。功能实验表明，GDF15具有抗肾纤维化作用，能够减轻ECM沉积和巨噬细胞浸润。机制上，GDF15通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进肾小管上皮细胞的自噬活动和溶酶体生物合成，从而发挥保护作用。这一发现为理解肾纤维化的发病机制提供了新的视角，并将GDF15确立为潜在的抗纤维化治疗靶点。
研究局限性
本研究存在一些局限性。首先，对照组患者年龄相对较轻，可能影响GDF15的表达水平。未来研究应纳入年龄匹配的样本和更大的队列以进行多变量分析。其次，虽然使用LY294002验证了PI3K/Akt/mTOR通路在GDF15介导的作用中的角色，但未进行针对Akt或mTOR的特异性干预。此外，组织分析所用的抗体未能区分前体GDF15和成熟GDF15，因此检测到的信号主要反映组织中的总GDF15水平，而血清ELISA主要测量成熟形式。关于受体机制，本研究仅验证了GFRAL的功能，未实验评估ErbB2的潜在作用。更明确的机制证据需要利用转基因或条件性基因敲除小鼠模型进行体内验证。
结论
综上所述，本研究表明GDF15在肾TIF中表达降低，且与肾TIF程度呈负相关。GDF15通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路，促进自噬和溶酶体功能，从而减轻ECM沉积，这可能是GDF15发挥肾脏保护作用的机制之一。这些发现揭示了GDF15在肾纤维化中的新角色，为其作为治疗靶点提供了理论依据。
