KCNQ2-5通道激活通过抑制网络驱动的钾电流消除4-氨基吡啶诱导的儿童癫痫组织超极化振荡

《Neurobiology of Disease》：4-Aminopyridine induced hyperpolarizing oscillations in pediatric human epileptic tissue are network-driven potassium currents that are abolished by activation of KCNQ2–5 (Kv7.2-Kv7.5) channels

本研究针对约30%的耐药性癫痫患儿，探究了4-氨基吡啶(4-AP)诱导的发作间期样超极化振荡(HypOs)机制。研究人员利用儿童癫痫患者及小鼠模型的新皮质组织，通过电生理技术发现，4-AP诱导的HypOs是网络驱动的钾电流，其产生不依赖GABAA/GABAB或谷氨酸受体，但需要钙离子和间隙连接参与。关键发现是KCNQ2-5(Kv7.2-Kv7.5)通道激活剂瑞替加宾可完全消除HypOs，为靶向KCNQ通道治疗癫痫提供了新见解。

　　

癫痫是世界上最常见的神经系统疾病之一，尽管有多种抗癫痫药物(ASMs)可用，但仍有约30%的患者会发展为药物耐药性癫痫。不幸的是，耐药性癫痫患者的发作机制仍未完全阐明。手术切除的耐药性癫痫患者脑组织为研究人类癫痫大脑提供了独特机会。其中，4-氨基吡啶(4-AP)作为一种电压门控钾通道阻断剂，常被用于诱导离体脑片的癫痫样活动，是研究癫痫机制的重要工具。

在这项发表于《Neurobiology of Disease》的研究中，J. Keenan Kushner等研究人员旨在阐明4-AP在人类癫痫新皮质中诱导的发作间期样振荡的机制。他们发现4-AP能够诱导神经元爆发和稳健的慢速超极化振荡(HypOs)，这些振荡是同步的网络事件，主要由钾电流介导，并且能被KCNQ2-5通道激活所消除。

研究人员主要采用了来自46名患者(40名癫痫患者和6名对照组)的皮质组织样本，以及通过子宫内电穿孔技术构建的皮质发育畸形(MCD)小鼠模型。关键实验技术包括急性人脑切片电生理学、全细胞膜片钳记录、不同内部溶液的使用以区分离子贡献、以及多种药理学工具的应用，包括GABA能受体拮抗剂、谷氨酸受体拮抗剂、钾通道调节剂、钙通道阻断剂和间隙连接阻断剂等。

3.1. 4-AP诱导的同步神经元爆发和超极化振荡(HypOs)

研究人员发现，4-AP(100 μM)在人类癫痫新皮质L2/3锥体神经元(PNs)中诱导出可重复且稳健的发作间期样振荡和神经元爆发。这些HypOs是缓慢(持续约1秒)、节律性(约0.1 Hz)的超极化振荡，并且在相邻的L2/3 PNs之间同步发生，表明是网络水平的振荡。与对照组组织相比，癫痫组织中的HypOs振幅显著更大，表明癫痫L2/3回路表现出更强的网络同步性。此外，HypOs的反转电位约为-69 mV，介于氯离子(E_Cl= -49.48 mV)和钾离子(E_K= -108.87 mV)的反转电位之间，提示两种离子可能都参与HypOs的产生。

3.2. 在癫痫小鼠模型中，癫痫组织的HypOs比对照组更大

为了在变异性较小的情况下比较癫痫和对照组组织，研究人员在癫痫小鼠模型中记录了HypOs。结果与人类组织中的发现相似，MCD小鼠的L2/3 PNs的HypOs振幅显著大于对照组，进一步支持了网络超兴奋性在放大HypOs中起主导作用的观点。

3.3. HypOs是网络事件，但并非主要由谷氨酸或GABA介导

实验表明，GABA_A受体拮抗剂(加巴嗪或荷包牡丹碱)和GABA_B受体拮抗剂(CGP35348或法克罗芬)的加入并未显著改变HypOs的振幅，但降低了其频率。同时，AMPA和NMDA受体拮抗剂(DNQX和D-APV)对HypOs的振幅和频率均无显著影响。而钠通道阻断剂河豚毒素(TTX)则完全消除了HypOs，证实HypOs是网络事件，而非单一细胞现象。这些结果表明，HypOs的产生不依赖于GABA能或谷氨酸能神经传递。

3.4. 钾电流介导4-AP诱导的HypOs

通过使用不同内部溶液的配对记录，研究人员发现当使用低钾内部溶液使钾反转电位去极化时，HypOs变为去极化，表明钾外流是HypOs超极化的重要基础。使用钾通道非特异性阻断剂四乙铵(TEA)可显著降低甚至消除HypOs。

3.5. 阳离子-氯离子协同转运体抑制导致HypOs振幅小幅降低

阻断Na⁺-K⁺-2Cl^?协同转运体(NKCC1)的布美他尼和阻断K⁺-Cl^?协同转运体(KCC2)的呋塞米对HypOs的影响有限，表明阳离子-氯离子协同转运体(CCCs)并非4-AP诱导HypOs的主要产生机制，但皮层钾/氯稳态的改变是网络驱动事件的基础。

3.6. 钾通道阻断可减少但不能消除HypOs

阻断不同种类的钾通道，如G蛋白门控内向整流钾通道(GIRK，用Tertiapin-Q)、小电导钙激活钾通道(SK，用阿帕敏)、大电导钙激活钾通道(BK，用Charybdotoxin)或KCNQ通道(用XE991)，只能部分降低HypOs的振幅或频率，而不能完全消除它们。

3.7. Kv7.2-Kv7.5 (KCNQ2–5)通道激活可消除4-AP诱导的HypOs

关键发现是，KCNQ2-5通道激活剂瑞替加宾(RTG, 50 μM)能够完全消除HypOs，其效果与TTX类似。这表明激活KCNQ通道可以通过稳定神经元活动、减少爆发性放电和网络同步化，从而阻止细胞外钾波动和HypOs的产生。

3.8. 细胞内钙影响HypOs

非选择性钙通道阻断剂氯化镉(CdCl₂)可完全消除HypOs。使用不同浓度的细胞内钙螯合剂BAPTA也显著降低了HypOs的振幅和频率，表明突触后细胞内钙动力学在4-AP诱导的HypOs中扮演重要角色。

3.9. 间隙连接促进同步化以调节4-AP诱导的HypOs

多种间隙连接阻断剂，如尼氟酸(NFA)、甲氯芬那酸(MFA)、卡泊芬净(CBX)和甲氟喹(MFLQ)，均能以不同方式减少HypOs的振幅和/或频率，甚至引起极性转换。这表明间隙连接(可能通过电耦合GABA能中间神经元或星形胶质细胞)在调节网络同步性和钾缓冲中部分参与了HypOs的生成。

研究结论与讨论部分强调，4-AP诱导的HypOs是由GABA能中间神经元同步化(通过神经传递和间隙连接实现)导致局部细胞外钾波动而产生的网络驱动钾电流，无需GABA神经传递参与。钾波动直接改变了谷氨酸能神经元的静息膜电位，从而产生HypOs。最重要的发现是KCNQ2-5通道的激活可以消除这些振荡，这为理解癫痫的发作间期活动机制和开发新的治疗策略(如靶向KCNQ通道)提供了重要依据。该研究揭示了癫痫脑组织中一种不依赖于经典神经递质的网络振荡新机制，指出稳定钾稳态可能是控制癫痫活动的有效策略。目前针对KCNQ2-5通道的药物(如BHV-7000)已进入临床试验阶段，本研究为其治疗潜力提供了坚实的实验证据。