《Journal of Integrative Plant Biology》：Biogenic retrograde signaling via GUN1 ensures thermotolerant chloroplast biogenesis during seedling establishment in Arabidopsis thaliana
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本研究揭示了拟南芥GUN1介导的生物发生逆行信号在热胁迫下幼苗建成过程中的关键作用。作者发现GUN1缺失导致严重白化和光形态建成受损，其机制与光合作用相关核基因（PhANGs）的去抑制表达及叶绿体活性氧（ROS）积累相关。研究进一步证明EXECUTER1（EX1）和EXECUTER2（EX2）通过调控GUN1突变体的热敏感表型，揭示了生物发生与操作性逆行信号通路间的交叉对话。该发现拓展了对GUN1功能的理解，阐明了其通过生物发生逆行信号在早期幼苗生长阶段调控叶绿体发育和热耐受性的新机制。
GUN1是幼苗发育过程中赋予热耐受性的关键因子
研究首先探讨了GUN1在非生物胁迫条件下幼苗建成过程中的作用。将野生型（WT）和gun1突变体种子从萌发开始置于高温（~30°C）或正常温度（~22°C）条件下培养。虽然WT幼苗在热胁迫（HS）下能够萌发并转绿，但其光系统II（PSII）量子产量（Fv/Fm）显著降低。相比之下，gun1幼苗完全白化，表明高温对WT和gun1都造成胁迫，但对WT的影响较轻。值得注意的是，部分gun1幼苗在正常条件下也会出现白色或浅绿色子叶的表型。
通过内源启动子驱动表达C端GFP标签的GUN1能够回补gun1的热敏感表型。免疫印迹分析显示，gun1突变体中由PhANGs（如LHCB1-4）和PhAPGs（如D1、D2和CP43）编码的光合作用相关蛋白显著减少，进一步支持其热敏感表型。LHCB2蛋白水平在gun1中受热胁迫影响较小，这可能是因为LHCB2在GUN1依赖性逆行信号研究中常被用作标记基因，其表达在gun1中去抑制最为显著。尽管GUN1-GFP蛋白在早期叶绿体生物发生过程中快速积累，且在对照和热胁迫下积累模式相似，但其转录本水平在热胁迫下显著降低，表明蛋白质丰度的增加可能源于蛋白质稳定性的增强而非转录诱导。
热白化的gun1子叶在转移到正常条件后无法恢复。虽然持续10天热胁迫的gun1幼苗的真叶比经过7天恢复期的真叶更大，但其Fv/Fm值更低，这表明GUN1对于胁迫后阶段真叶光合活性的完全恢复是必需的。
GUN1过表达增强热耐受性
与GUN1突变的效果形成鲜明对比，GUN1的过表达改善了幼苗发育过程中的热耐受性。在gun1背景下，使用组成型35S启动子（Pro35S）或天然GUN1启动子（ProGUN1）表达GUN1-GFP的四个独立转基因株系，均显示出GUN1剂量依赖性的热耐受性增强。GUN1蛋白丰度与幼苗热耐受性（以Fv/Fm值和PSII核心蛋白D1、D2的稳态水平为指标）之间存在强烈的正相关性。此外，这些热胁迫幼苗叶肉细胞的透射电子显微镜图像揭示了GUN1在热胁迫下维持叶绿体生物发生中的关键作用。WT和表达GUN1-GFP的gun1转基因幼苗的叶绿体显示出具有线性基质片层的基粒堆叠，而这些结构在gun1突变体幼苗中完全缺失。
生物发生逆行信号对于维持热耐受性至关重要
是什么导致gun1在早期幼苗发育过程中热耐受性失败？GUN1介导的生物发生逆行信号（GUN1-bioRS）对于获得热耐受性是否必需？GUN1-bioRS在NF或LIN存在下会抑制GLK1/2表达及其下游靶基因。因此，研究人员检测了WT和gun1在萌发过程中LHCB1.4的转录本丰度。RT-qPCR分析显示，GUN1突变导致LHCB1.4相对于WT显著上调，尤其是在热胁迫下。这些结果表明，热胁迫质体在吸胀开始后12小时就激活GUN1-bioRS以抑制LHCB1.4表达；虽然在正常条件下不太明显，但与WT相比，gun1中的LHCB1.4也上调了。
为了进一步验证这一点，研究人员分析了在正常和热胁迫条件下受GUN1缺失影响的mRNA转录组。全基因组RNA测序和顶级富集的KEGG分析揭示了gun1在控制PhANGs表达方面的显著损伤。在热胁迫下吸胀12小时后，与WT相比，gun1中有57个基因显著上调（变化倍数大于2，错误发现率FDR < 0.05）。其中，19个被鉴定为PhANGs。随后的RT-qPCR分析也证实了GLK1及其靶基因（如LHCBs）在gun1中相对于WT显著上调。此外，来自RT-qPCR和mRNA转录组的表达比率（30°C/22°C）分析表明，GUN1突变导致PhANGs的去抑制比WT更明显。
鉴于GUN1–GLK1模块协调bioRS，且GLK1/2转录因子功能冗余，研究人员利用gun1glk1glk2三敲除突变体研究了GLK1/2在GUN1依赖性热耐受性中的作用。随后的热胁迫实验强调了GUN1-bioRS的重要作用，gun1glk1glk2幼苗的热耐受性得到显著恢复。值得注意的是，glk1glk2幼苗显示出比WT幼苗更高的Fv/Fm，表明PhANGs表达的轻微降低可能会提高热胁迫下的PSII量子产量。RT-qPCR分析也证实了gun1glk1glk2中LHCBs的表达相对于gun1降低。与PhANGs不同，在gun1与WT之间未观察到PhAPGs（如psbA和psbD）的显著变化。随后的免疫印迹分析显示，gun1glk1glk2中LHCB蛋白水平部分恢复，psbA编码的D1和psbD编码的D2蛋白水平显著升高。推测该背景下氧化胁迫的减少稳定了PSII核心蛋白，从而增加了它们的稳态水平。值得注意的是，LHCBs的较高水平仅在较早阶段（吸胀后36小时）观察到，在热敏感表型出现之前。一旦表型变得明显，LHCB蛋白水平显著下降，这与gun1幼苗的热敏感表型一致。这种阶段依赖性模式突出了GUN1在热胁迫下早期叶绿体生物发生中的关键作用。
受损的生物发生逆行信号导致ROS积累
之前的研究表明，PhANGs的 uncoupled expression，特别是LHCBs相对于PhAPGs的上调，会导致拟南芥lsd1突变体叶绿体中1O2水平升高。SA诱导的PhANGs上调，特别是那些编码PSII LHCB蛋白的基因，会诱导叶绿体中1O2水平增加。这进而激活EX1介导的操作性逆行信号，导致叶片细胞死亡。基于此，研究人员假设，由GLK1/2去抑制部分驱动的PhANGs表达增强可能同样诱导ROS，可能促成gun1的热敏感表型。
随后评估了细胞ROS水平，包括超氧阴离子（O2?）、过氧化氢（H2O2）和1O2。正如预期，与WT幼苗相比，在热胁迫下发育的gun1幼苗导致更高的ROS积累。此外，在缺失GLK1/2的gun1中不再观察到升高的ROS水平。还观察到gun1中的叶绿素自发荧光比WT更强，而GLK1/2的缺失降低了这种效应。增加的叶绿素自发荧光可能是由于光合装置组装不平衡，导致吸收光能的光化学猝灭减少。结果，能量可以通过叶绿素荧光消散或转化为热或ROS。
热休克蛋白HSP17.4和HSP17.6A已知会被氧化胁迫和H2O2处理强烈诱导。研究人员也证实了HSPs在gun1中的显著上调。uncoupled genome诱导的ROS生成可能是gun1在热胁迫下HSPs诱导的原因。与此观点一致，GLK1/2的失活显著减弱了gun1中HSPs的表达。这些发现表明，升高的ROS水平导致gun1子叶白化并抑制叶绿体生物发生。
热胁迫下gun1中激活了EX1依赖性操作性逆行信号
随后研究人员失活了叶绿体1O2传感器EX1，假设破坏EX1介导的操作性逆行信号（EX1-opRS）可能会改变gun1表型。确实，EX1的缺失部分缓解了gun1的热敏感性，这表明其他ROS，如O2?和H2O2，也可能导致子叶白化。为了进一步验证EX1-opRS在热胁迫诱导的gun1表型中的作用，研究人员在Pro35S控制下表达了GFP标记的EX1或缺少C端1O2传感器（SOS）结构域的截短EX1（之前注释为未知功能结构域DUF3506）。先前研究表明，SOS结构域对于EX1的类囊体膜关联和感知临界1O2水平至关重要。值得注意的是，在gun1ex1中过表达EX1ΔSOS-GFP未能恢复gun1的热敏感表型。相比之下，过表达全长EX1-GFP完全恢复了gun1ex1的缺陷，突出了1O2触发的EX1信号激活在介导gun1热敏感反应中的重要性。EX1缺失在gun1中的影响在延长热暴露10天后变得更加明显。此外，ex1幼苗显示出比WT幼苗增强的热耐受性，Fv/Fm值显著更高。
最近有报道称，EX1在质体中释放1O2后重新定位于细胞核。然而，在用已知会劫持EX1信号以促进叶片致病性的霉菌毒素处理的拟南芥植物中未检测到核EX1信号。而且，最近的研究通过共聚焦显微镜和亚细胞分级分离实验证实，定位于叶绿体的EX1蛋白在1O2产生后不会重新定位到细胞核。同样，在热胁迫下生长的gun1ex1oeEX1和gun1ex1oeEX1?SOS幼苗中未观察到核GFP信号。尽管如此，与降低的热敏感性一致，HSPs的表达在gun1ex1中不如在gun1中显著。
EX2缺失通过拮抗EX1的作用加剧gun1的热敏感性
鉴于EX1在促成gun1热敏感表型中的作用，研究人员接下来检测了EX1样蛋白EX2的功能，已知其缺失会增强EX1依赖性的1O2信号。引人注目的是，EX2的缺失进一步加剧了gun1的热敏感性，并显著增加了HSPs的表达。gun1ex1和gun1ex2之间对比的热敏感性验证了先前的发现，即EX2在叶绿体中过量1O2产生下拮抗EX1信号。一致地，ex1突变体表现出增强的热耐受性，而ex2突变体相对于WT表现出降低的热耐受性，反映了它们在1O2信号中的相反作用。在正常条件下，gun1ex2幼苗出现白色或浅绿色子叶的比例高于gun1，而这些表型在gun1ex1中完全逆转。类似地，GLK1/2的失活导致比WT更高的Fv/Fm值，并且gun1的异常子叶表型在gun1glk1glk2幼苗中 largely suppressed。
EX1和EX2相反地调控热胁迫下真叶中的叶绿体生物发生
接下来研究人员探究了EX1和EX2是否影响真叶中的热耐受叶绿体生物发生。通过透射电子显微镜检查了热处理后不同阶段的叶绿体超微结构。在子叶中，GUN1的缺失严重破坏了叶绿体组织。与恢复的植株表型一致，GLK1/2或EX1的额外突变部分改善了gun1背景下的这些类囊体缺陷，导致更密集堆叠的基粒。相比之下，EX2的缺失未能抑制gun1中的叶绿体缺陷；gun1ex2双突变体显示出类似 disorganized 的类囊体膜。
在真叶中观察到了可比拟的模式。与WT幼苗相比，gun1突变体包含更多无序的基粒堆叠。ex2突变进一步加剧了这种破坏，导致类囊体膜系统近乎完全丧失。相反，与在真叶中的观察一致，gun1背景下的GLK1/2或EX1突变 largely preserved 类囊体结构，维持了完整且界限清晰的基粒堆叠。这些发现表明，GUN1在热胁迫下调控叶绿体生物发生的作用在子叶和真叶中是一致的，并且EX1和EX2对此过程施加相反的影响。
正常条件下gun1中PhANGs相对于WT上调
鉴于EX1和EX2的显著影响，以及部分gun1幼苗在正常生长条件下出现白色或浅绿色子叶的现象，可以合理推断gun1在正常条件下的表型源于光合作用相关核基因和质体基因的 uncoupled expression。为了进一步研究这一点，研究人员进行了全基因组转录组分析，比较了正常条件下吸胀24小时后WT和gun1中PhANGs和PhAPGs的表达水平。选择这个时间点是基于图3A中的RT-qPCR结果，该结果显示WT和gun1之间LHCB1.4表达水平差异最显著。正如预测的，检测到gun1中42个PhANGs相对于WT显著上调。表达变化至少两倍且FDR小于0.05的基因被认为是显著差异表达。然而，未观察到PhAPG表达的明显变化。这些结果表明，上调的PhANGs和未变化的PhAPGs的 uncoupled expression 可能阻碍了gun1萌发后的叶绿体生物发生。
GLK过表达通过增强PhANG表达加剧gun1表型
注意到PhANGs表达的减少部分缓解了gun1的热敏感性，研究人员假设进一步增加PhANG表达可能会加剧热胁迫下的gun1表型。为此，研究人员产生了在Pro35S下过表达GLK1-GFP或GLK2-GFP的gun1glk1glk2转基因幼苗，并评估了它们对gun1表型的影响。正如先前报道的，这些GLK转录因子的过表达导致根变绿。随后的RT-qPCR和免疫印迹分析证实，GLK1-GFP或GLK2-GFP的过表达显著增加了PhANGs的稳态水平和相应的蛋白质丰度。与假设一致，这些转基因幼苗在正常和热胁迫下显示出增强的子叶光漂白。此外，它们在gun1glk1glk2背景下的过表达导致HSPs表达升高，与gun1glk1glk2中相对于gun1降低的HSPs表达形成对比。总之，这些发现表明，光合作用相关基因的 uncoupled expression（无论是由于GUN1-bioRS受损还是gun1中GLK1/2的过表达）对叶绿体生物产生生负面影响。这些变化部分归因于ROS稳态的破坏和EX1/2依赖性opRS的激活。
GUN1过表达可能通过抑制PhANG表达增强gun1的热耐受性
本研究的累积发现表明，gun1突变体中观察到的热敏感性与升高的PhANGs水平密切相关，突出了GUN1-bioRS通过适当抑制PhANG表达在热胁迫下维持叶绿体生物发生中的必要性。支持这一点的是，GUN1过表达导致GLK1和LHCB表达剂量依赖性的、相对于WT和gun1的显著降低。此外，WT、gun1和两个独立GUN1过表达株系中LHCB转录本水平与Fv/Fm值之间的负相关进一步支持了PhANGs相对于PhAPGs的表达升高驱动了gun1在热胁迫下的光漂白观点。这突出了光合作用相关核基因和质体基因的协调表达作为连接早期幼苗发育过程中热胁迫下生物发生和操作性逆行信号的中心枢纽的重要性。
热胁迫下gun1中RNA编辑无明显缺陷
GUN1在干扰RS的条件下在RNA编辑中的作用促使研究人员调查该功能是否也是热耐受性所必需的，考虑到叶绿体RNA编辑对热高度敏感。研究人员检测了GUN1下已知的RNA编辑位点，在热胁迫下未观察到gun1中叶绿体基因RNA编辑效率的一致显著改变。因此，GUN1介导的叶绿体RNA代谢是否作为PPR蛋白有助于热耐受性仍有待研究。
讨论
本研究强调了基因组耦合表达（genomes coupled expression）的生物学意义，这一概念是三十多年前Joanne Chory教授课题组发现gun突变体时引入的。尽管相关的生物发生逆行信号通路已被广泛研究，但令人惊讶的是，基因组耦合表达在正常或胁迫条件下的意义在很大程度上仍未得到探索。
在gun突变体中，gun1由于其在线霉素（LIN）或萘去津（NF）补充培养基上的基因组去耦合表达（genomes uncoupled expression）表型而被广泛研究。GUN1在早期叶绿体生物发生过程中积累，部分gun1幼苗显示白色或浅绿色子叶，表明需要阈值的GUN1水平才能实现及时的叶绿体发育。尽管GUN1是组成型转录的，但它通过与叶绿体伴侣蛋白ClpC1（Clp蛋白酶系统的组分）相互作用而持续周转，在非胁迫条件下促进快速降解。然而，在早期叶绿体生物发生过程中，GUN1是稳定的。一致地，研究人员观察到GUN1在热胁迫下稳定，突出了翻译后调控在促进叶绿体发育中的重要性。此外，具有白色或浅绿色子叶的gun1幼苗显示出质体转录本的广泛改变，暗示GUN1参与质体RNA代谢。
除了在线霉素或NF条件下在bioRS中的作用外，本研究证明GUN1对于热胁迫下的早期叶绿体生物发生至关重要。热胁迫下子叶的光漂白可能源于bioRS受损，这一点得到了gun1glk1glk2突变体的支持，该突变体缺乏关键的下游转录因子GLK1/2。GLK1/2的缺失损害了PhANG表达，并部分挽救了热胁迫下的gun1表型，强调了GUN1在胁迫期间协调核-质体基因表达中的作用。
本研究未阐明GUN1-bioRS介导GLK1/2转录抑制的机制。最近的研究发现，GUN1在NF或LIN存在下参与核编码的叶绿体蛋白（包括ClpD）的输入。因此，GUN1的缺失导致未输入的前体蛋白积累，引发叶绿体前体过度积累胁迫（cPOS）反应，该反应与GLK1和GLK2及其下游PhANGs的下调相关。然而，ClpD的过表达及其在细胞质中作为前体形式的积累被证明会增加ROS水平，这与本研究发现的GLK1和GLK2抑制缓解gun1中升高的ROS表型相矛盾。因此，cPOS通路是否有助于本研究中观察到的热敏感表型仍不清楚。
光合作用相关基因的 uncoupled expression 导致EX1/2依赖性操作性逆行信号的激活，这是由升高的1O2水平驱动的。研究人员先前强调了EX1-Trp-643在C端SOS结构域内的氧化在启动1O2信号中的关键作用。实验证据包括用1O2不敏感残基替换Trp-643或完全删除SOS结构域，两者都会导致1O2信号的废除。虽然最近的报道提出EX1在质体中释放1O2后核重新定位及其与WRKY18/40转录因子的相互作用对于调控1O2响应核基因的表达至关重要，但在热胁迫下未能检测到EX1-GFP融合蛋白的任何核信号，即使在用霉菌毒素TeA（在叶绿体中诱导1O2爆发并激活EX1介导的逆行信号）处理的拟南芥成熟植株中也是如此。因此，所建议的EX1核重新定位需要进一步验证。
EX1介导的信号在子叶白化中的重要作用表明，GUN1–GLK模块对于维持早期幼苗发育过程中的质体ROS稳态至关重要。最近，BBX家族成员BBX16被鉴定为一种新的GLK1靶标，影响光形态建成，并作为激活逆行信号的关键点。作为GLK1的下游靶标，BBX16通过确保有效的光保护来优化幼苗去黄化。另一项研究阐明了GUN1介导的逆行信号在暗形态建成和早期光响应中限制叶绿体发育的作用，从而保护幼苗从黑暗中出土。此外，BPG4（Brz-insensitive, pale green）其表达由油菜素内酯缺乏和光诱导，与GLK1/2相互作用以抑制它们的活性。因此，BPG4的缺失增强了PhANGs的表达，伴随着ROS爆发和Fv/Fm降低。然而，鉴于GLK在LHCII生物发生中的既定作用，不能排除对glk1glk2在正常条件下升高Fv/Fm的另一种解释——即减少的LHCII积累（而PSII核心不受影响）可能独立于ROS水平增加Fv/Fm。这种可能性值得进一步研究。
由于独立研究阐明了GUN1在冷驯化中的关键作用，可以认为GUN1是一种潜在的温度传感器，指导PhANGs响应温度变化的协调表达。这一观点挑战了被广泛接受的将GUN1仅仅视为生物发生逆行信号主整合器的观点，而是表明GUN1可能作为连接叶绿体发育与适应性胁迫反应的关键介质，从而桥接生物发生和操作性逆行信号通路。最近发现揭示GUN1在四吡咯生物合成、蛋白质稳态和蛋白质输入中的多种功能，也引发了关于它们在正常和胁迫条件下早期叶绿体生物发生过程中调控PhANGs表达潜在作用的问题。未来需要进一步研究这些过程如何与GUN1在各种环境条件下保护叶绿体生物发生的功能相互作用。
