《Journal of Medical Virology》：Unraveling Cytomegalovirus Drug Resistance in Transplant Patients by Targeting Deep Sequencing
1 引言
移植受者因免疫抑制状态和长期抗病毒药物暴露，在管理巨细胞病毒（CMV）感染方面面临严峻挑战，抗病毒耐药性的出现是导致治疗失败和发病率增加的主要原因。当CMV病毒载量在至少2周的抗病毒治疗后升高超过1 log10 IU/mL或未能下降时，应怀疑存在抗病毒耐药。CMV耐药性通过检测编码抗病毒靶点的基因中的特定突变来识别，其发展与每种临床病例所使用的抗病毒药物密切相关。
抗病毒耐药突变（ARM）是CMV对更昔洛韦（GCV）、缬更昔洛韦（VGCV）产生耐药的主要机制，与马立巴韦（MBV）耐药相关的ARM也有报道。大多数临床系列报告中涉及的ARM集中在UL97激酶，常见的氨基酸置换位点包括M460V/I、H520Q、C592G、A594V、L595S和C603W。此外，集中在密码子590至607之间的较少见ARM也与GCV耐药有关。
CMV DNA聚合酶基因UL54中的ARM与聚合酶抑制剂（包括GCV、VGCV、以及不依赖病毒激酶的膦甲酸（FOS）和西多福韦（CDV））的耐药相关。UL54中的ARM通常聚集在DNA聚合酶的功能域，并表现出不同的耐药表型。新的ARM不断被识别，其中一些导致对多种抗病毒药物（包括FOS）的交叉耐药。这些ARM通常在长期抗病毒暴露后出现。UL97和UL54中ARM共存可导致更高水平的GCV耐药。
近年来，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了两种新的CMV抗病毒药物。马立巴韦（MBV）是一种UL97激酶抑制剂，适用于治疗对GCV、VGCV、CDV或FOS难治（伴或不伴基因型耐药）的移植后CMV感染或疾病。除UL97外，MBV耐药也与编码病毒核蛋白的UL27基因突变相关。来特莫韦（LET）是一种CMV DNA终止酶复合物抑制剂，被批准用于CMV血清阳性成人造血干细胞移植（HSCT）受者和高危肾移植受者的CMV感染预防。病毒终止酶复合物由UL56、UL89和UL51基因编码，在通过滚环复制进行DNA复制后，在病毒基因组的切割和包装中起关键作用。LET耐药主要与UL56突变相关，尽管UL89和UL51突变也有报道。值得注意的是，UL51突变由于其低适应性代价，可能增强UL56突变所赋予的耐药性。体外研究已在UL56的231至369密码子之间识别出LET耐药突变，表明其耐药遗传屏障较低。
在临床实践中，对抗病毒耐药CMV的实验室检测至关重要，因为许多持续性病毒血症病例与抗病毒耐药无关。由于病毒培养在常规诊断中的使用减少，基因型检测已成为检测抗病毒耐药的主要方法。对于常规检测，UL97和UL54（针对GCV/VGCV/FOS耐药）以及UL56（针对LET耐药）的Sanger测序仍然是最常用的方法。然而，在研究和临床试验环境中，扩展测序可能包括用于MBV耐药的UL27，以及用于LET耐药的UL51、UL56和UL89。
近年来，下一代测序（NGS）已成为检测CMV ARM的一种有前景的技术，已有若干研究评估其与Sanger测序相比的临床效用和成本效益。NGS具有多个优势：更高的灵敏度，能够在病毒载量低至500 IU/mL时检测耐药变异；能够检测占病毒群体5%–15%的次要变异，而Sanger测序的检测限约为20%；通过基因和样本的多重测序，具有更高的效率和成本效益的潜力。然而，迄今为止的大多数研究仅关注UL97和UL54，而UL89和UL51中的耐药突变——尽管目前较少见——随着LET使用的日益增多可能变得越来越相关。尽管有这些优势，NGS在临床实验室的常规实施仍然有限，原因包括技术复杂性、周转时间较长、需要生物信息学专业知识以及数据解读方面的挑战。此外，只有少数研究将NGS应用于较大患者队列的CMV耐药检测，且大多数仅限于UL97和UL54的分析。
本研究的主要目的是开发并应用一种通过NGS检测移植受者六个靶基因（UL27、UL51、UL54、UL56、UL89和UL97）中ARM的方法学。该方法旨在扩展当前对CMV耐药的认识，并强调基于NGS的ARM检测在临床实践中的相关性。次要目标包括探索ARM检测与临床变量（如病毒载量、移植类型、治疗史和患者结局）之间的潜在关联。
2 材料与方法
2.1 患者与临床样本
这项回顾性研究通过NGS分析了来自68名CMV DNA阳性移植患者的71份临床样本。所有样本先前均已提交至国家微生物中心（CNM）进行Sanger测序基因型检测，样本来源于西班牙各地的医院。样本采集时间为2018年1月至2024年4月。部分患者有多个连续临床样本可供分析。本研究明确包括两个队列：来自Hospital Puerta de Hierro的单中心队列（n = 35），具有详细的临床数据；以及来自西班牙多家医院的33名患者组成的多中心队列，无相关的临床/人口统计学数据。
患者分为三组。第一组包括来自Hospital Puerta de Hierro、无临床怀疑CMV耐药的患者（治疗应答者；n = 13）。第二组包括来自Hospital Puerta de Hierro、临床怀疑抗病毒耐药的患者（n = 22）。对于所有来自Hospital Puerta de Hierro的患者（n = 35），可获得临床记录，从而能够收集风险因素、临床状况和结局数据。第三组包括临床怀疑耐药、其样本从西班牙各地医院提交至CNM进行耐药基因分型的患者（n = 33）；该组患者因CNM组合下的数据保护规定而无法获得临床或人口统计学数据。所有样本均为储存于-80°C的残留血浆或血液。
Hospital Puerta de Hierro患者的中位年龄为57岁。其中，16名患者接受了实体器官移植（SOT）——包括肾移植（n = 7）、肺移植（n = 5）、心脏移植（n = 2）和肝移植（n = 2）——19名患者接受了造血干细胞移植（HSCT）。耐药和难治性CMV感染的定义应用标准化标准。第1组和第2组患者的个体治疗方案、病毒载量、人口统计学数据和临床变量总结于附表S6。
阳性对照包括用于诊断目的的体外培养病毒提取的CMV DNA。阴性对照包括先前实时PCR检测CMV阴性的血浆和血液样本。
本研究获得了卡洛斯三世健康研究所伦理委员会的批准（CEI PI 11_2021-v3）。
2.2 临床样本DNA提取
使用自动提取仪（QIAsymphony, Qiagen）和商业试剂盒（QIAsymphony Virus/Bacteria Midi Kit (96), Qiagen）按照制造商说明进行提取。
2.3 通过特异性巢式PCR扩增富集CMV DNA
基于GenBank中的CMV共识序列，设计了巢式PCR以扩增每个完整的靶基因。第一轮PCR使用六对外部引物，第二轮使用另外六对内部引物。反应在Biorad C1000 Touch Thermal Cycler中使用Platinum SuperFi II DNA Polymerase（Thermo Fisher Scientific, Invitrogen）进行，根据制造商说明，并在所有反应中加入Q5 High GC Enhancer（New England Biolabs），终体积为50 μL。PCR产物储存于-20°C，直至用于NGS DNA文库制备。用于扩增UL27、UL51、UL54、UL56、UL89和UL97基因的引物组、扩增子大小和巢式PCR条件见表S1–S3。
2.4 工作流程中的DNA定量与质量控制
所有临床样本中的CMV病毒载量均使用参考实验室（国家微生物中心）常规使用的、经过验证的实时PCR assay进行定量，并使用WHO标准。
在研究过程中，在多个阶段对DNA进行定量，包括提取后、巢式PCR扩增后以及文库制备后。使用QuantiFluor dsDNA System和Quantus Fluorometer（Promega）进行定量，按照制造商说明，以ng/μL表示。通过琼脂糖凝胶电泳（1%，TAE缓冲液）使用FastRuler Middle Range DNA ladder（Thermo Fisher Scientific）验证扩增子完整性。电泳在90 V下进行45分钟。
最终文库的质量和片段大小在基因组学部门（国家微生物中心）使用Agilent 4150 TapeStation system进行评估。根据文库浓度选择DNA ScreenTape或High Sensitivity ScreenTape kits（Agilent）以确定大小分布、质量和DNA浓度。
2.5 文库合并与DNA文库制备
第二轮巢式PCR后，每个临床样本产生六个对应于靶基因的扩增子。为制备NGS DNA文库，将所得PCR产物按每个临床样本合并到一个管中。每个合并样本调整至终体积26 μL，包含100 ng总DNA，遵循NEBNext Multiplex Oligos for Illumina protocol（New England Biolabs）的建议。共生成73个文库，对应于71个临床样本和两个额外对照（阳性和阴性）。然后使用NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（Dual Index Primers Set 1 and 2）进行文库构建，该试剂盒允许最多96个样本的多重测序。文库制备按照制造商说明进行。测序前对DNA文库进行最终定量。
2.6 Sanger双脱氧测序
简要而言，Sanger双脱氧测序按照Tarragó等人和Gómez等人的详细方法进行。之后，所有序列均使用MEGA 7软件下载、比对和翻译，以人疱疹病毒5（Merlin株）的UL54和UL97基因序列作为参考序列（NCBI参考序列：NC_006273.2）。
2.7 NGS与原始数据的生物信息学分析
测序由ISCIII的基因组学单元使用NextSeq 500 Illumina平台进行，使用NextSeq 500 cartridge，其通量高达1.3亿条reads，对150 bp片段进行双端测序。根据先前研究，将避免假阳性结果的检测限定义为5%。
获得的原始FASTQ序列发送至ISCIII的生物信息学单元，通过nf-core/viralrecon生物信息学流程进行处理和分析。NGS数据使用viralrecon流程（nf-core/BU-ISCIII，在Nextflow DSL2中实现，使用Docker/Singularity容器）处理，以确保计算步骤的完全可重复性和可追溯性。
工作流程包括以下阶段：使用FastQC进行原始reads质量控制和使用fastp进行接头及低质量碱基修剪；使用Kraken2去除宿主reads（仅限Illumina数据）；使用Bowtie2将reads比对至CMV参考基因组（GenBank登录号NC_006273.2），随后使用SAMtools进行排序和索引；对于扩增子数据，使用iVar进行引物修剪；使用Picard进行重复标记；使用mosdepth计算覆盖度指标；使用iVar variants（扩增子数据）或BCFTools（宏基因组数据）进行变异调用，使用最小变异频率阈值5%、最小碱基质量20和最小覆盖深度10×。低于这些阈值的变异被排除。使用iVar consensus生成共识序列，要求最小等位基因频率50%来调用碱基，否则报告"N"；使用SnpEff和SnpSift对变异进行功能注释，以确定氨基酸变化和对抗病毒耐药基因的潜在影响；使用QUAST进行基因组组装质量评估，并生成全基因组覆盖度图以可视化测序深度；使用MultiQC生成整合所有QC和分析步骤的总结报告。所有步骤均使用固定工具版本的容器化环境执行，以保证可重复性。该流程公开于
https://github.com/BU-ISCIII/viralrecon 。
2.8 ARM表征
根据先前公布的数据，进行ARM与不涉及抗病毒耐药的突变的表征。
2.9 统计分析
所有统计分析均使用SPSS软件版本25（IBM Corporation Inc.）进行。使用χ2检验或Student t检验检验临床状况、风险因素与ARM存在之间的关联。当样本量较小时，使用Fisher精确检验估计分类变量及其交互作用的效应。由于数据非正态分布，使用非参数Mann–Whitney U检验评估有突变和无突变组之间病毒载量的差异。使用McNemar检验评估NGS和Sanger测序之间的一致性。除非另有说明，统计学显著性设定为p < 0.05（95%置信水平）。
3 结果
3.1 临床样本测序与NGS检测到的ARM
通过NGS成功对71份临床样本中的34份完整测序了所有靶基因。每个基因的详细信息见表1。
表1. 靶向PCR NGS成功处理的临床样本数量及比率。
基因靶点
UL27
UL51
UL54
UL56
UL89
UL97
N
55
63
62
69
55
63
%
77.5
88.7
87.3
97.2
87
88.7
NGS鉴定出的最常见ARM是A594V（n = 11）、C603W（n = 9）、L595S（n = 7）、T409M（n = 7）和D301N（n = 3）。这些置换位于UL97蛋白激酶（GCV的关键靶点）中，并与该药物的敏感性降低或耐药性持续相关。特别是，A594V和L595S是全球描述的最普遍的耐药突变之一，与移植受者GCV治疗的临床失败密切相关。C603W也赋予显著的GCV耐药性，尽管在临床队列中较少见。T409M已被报道可降低GCV敏感性，常与其他UL97突变组合出现，并导致累积耐药。D301N被描述为具有中等影响的相关耐药突变，当与其他置换共存时可能有助于降低GCV疗效。这些明确表征的ARM的检测凸显了NGS在识别可能损害免疫抑制患者抗病毒治疗的显性和次要耐药变异方面的临床意义。ARM队列总结见表2。
表2. ARM队列总结。
队列/分母
任何ARM
UL97 ARM
UL54 ARM
UL54 + UL97 (共存)
仅UL54
3.2 — 无怀疑 (患者 n=13; 样本 n=16)
3
3
0
0
0
3.3 — 有怀疑 (样本 n=55)
34
33
5
4
1
UL97和UL54耐药突变图谱及患者计数（靶向NGS）以及全球药物总数见图1A（UL97）、图1B（UL54）和图1C（全球药物总数）。
3.2 无临床耐药怀疑的移植受者中的ARM
我们分析了来自13名无先验耐药怀疑患者（Hospital Puerta de Hierro）的16份样本。在患者水平上，3/13（23.1%）通过NGS携带UL97 ARM，而未检测到UL54 ARM（表3）。重要的是，在该队列中，Sanger测序报告所有病例均为敏感/敏感（S/S），包括那三名UL97-ARM患者，这强调了NGS对未怀疑耐药性的额外检出率。样本水平的完整结果提供于附表S4。如表S5所示，一些样本由于覆盖度低/模糊而在UL97中显示不确定调用。
表3. 无怀疑队列中按基因列出的主要ARM计数。
基因
ARM
患者 (n)
样本 (n)
UL54
— (未检测到)
0
0
UL97
A594V
2
2
UL97
C603W
1
1
3.3 有临床耐药怀疑的移植受者中的ARM
我们对55名怀疑耐药患者（55份样本）的55份临床样本进行了测序。通过NGS发现，任何基因型耐药（UL97和/或UL54）存在于34/55（61.8%）样本中。UL97 ARM在33/55（60.0%）中检测到，UL54 ARM在5/55（9.1%）中检测到。除一例样本外，UL54 ARM均与UL97 ARM共存（该例外携带UL54 D301N且UL97敏感）。最常见的UL97 ARM是A594V（n = 9）、C603W（n = 8）和L595S（n = 7）。对于UL54，在三份样本中观察到D301N。有怀疑队列中按基因列出的ARM计数显示在表4中。样本水平的完整结果提供于附表S5。
表4. 有怀疑队列中按基因列出的主要ARM计数。
UL97 ARM
n
UL54 ARM
n
A594V
9
D301N
3
C603W
8
A692V
1
L595S
7
T503I
1
T409M
7
T691A
1
H411Y
2
M460I
2
A834P
1
C480F
1
C592G
1
H411L
1
L397R
1
L501I
1
L516R
1
3.4 NGS与Sanger测序检测到的ARM比较
Sanger测序检测到的所有ARM也均由NGS识别。相比之下，NGS在37名患者（54.4%）中总共检测到51个ARM，而Sanger测序仅在8名患者（11.8%）中检测到15个ARM。在31名患者中，两种方法均未检测到ARM。NGS识别出的ARM阳性患者数量显著多于Sanger测序（McNemar检验：χ2≈27.03, p < 0.00001）。
对UL54基因的ARM分析显示，NGS检测到总共6个ARM，涉及5名患者，其中仅3个ARM（涉及2名患者）被Sanger测序识别。NGS检测到的最常见UL54突变是D301N（n = 3），该突变未被Sanger测序检测到。
对于UL97基因，NGS在36名患者中识别出45个ARM，而Sanger测序仅在6名患者中检测到12个ARM。NGS检测到的最频繁突变是A594V（n = 11）、C603W（n = 9）、L595S（n = 7）、T409M（n = 7），其次是H411Y/L（n = 3）、M460I（n = 2），其余ARM各检测到一次。值得注意的是，大多数ARM仅由NGS检测到，Sanger测序遗漏了几个关键突变，包括C603W（n = 9）、D301N（n = 3）和C592G（n = 1）。
最后，考虑跨17种不同ARM类型的检测率（表5），进行了McNemar检验以比较两种方法。NGS检测到全部17种ARM，而Sanger测序仅检测到13种。有4种突变被NGS识别但被Sanger遗漏。McNemar检验表明，这种差异在0.05水平上无统计学意义（χ2(1, N=17) = 2.25, p = 0.134）。需注意，患者水平检测（每名患者的存在/缺失）和突变水平检测（跨17种ARM类型）是不同的分析；前者具有显著性，后者则不显著。
表5. NGS和Sanger测序检测到的UL54和UL97 ARM。
ARM
NGS
Sanger
药物
耐药水平
基因
A594V
11
1
GCV, CDV
高
UL97
C603W
9
0
GCV
中等
UL97
T409M
7
2
MBV
高
UL97
L595S
7
1
GCV
高
UL97
H411L/Y
3
1
MBV
高
UL97
M460I
2
1
GCV
中等
UL97
A834P
1
1
GCV
未知
UL97
C480F
1
1
MBV
中等
UL97
C592G
1
0
GCV
中等
UL97
L397R
1
1
GCV, CDV
低/中等
UL97
L501I
1
1
GCV
低
UL97
L516R
1
1
GCV
低
UL97
T503I
1
1
GCV
低
UL54
T691A
1
1
FOS
中等
UL54
D301N
3
0
FOS
高
UL54
A692V
1
1
FOS
高
UL54
然而，对原始Sanger测序数据的分析表明，ARM的次要亚群未被检测到，例如ARM M460I，这在样本72中得到了例证。Sanger色谱图分析排除了被认为是背景或噪音的次要群体，如图2所示。
3.5 患者临床状况与病毒学发现
在68名研究患者中，可获得来自Hospital Universitario Puerta de Hierro的35名患者的详细临床记录（中位年龄57岁；80%为男性）。移植程序包括HSCT（n = 1 9 ）
