《Poultry Science》：First Detection of Natural Co-infection with Mutated Very Virulent IBDV (mvvIBDV) and Novel Variant IBDV (nVarIBDV)
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本研究首次在田间样本中发现并证实了鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的两种重要变异株——突变超强毒株（mvvIBDV，基因型A3B3）和新变种（nVarIBDV，基因型A2dB1）在单一宿主中的自然共感染现象。通过RT-PCR、T载体克隆、测序及二代测序（NGS）技术，研究人员从法氏囊样本中鉴定出两种病毒株，并证实其共感染状态可在SPF鸡中稳定传代4代。该发现揭示了IBDV田间流行的复杂性，强调了共感染可能导致基因组重配或重组，进而产生新变异株的风险，对家禽业非典型IBD的防控和疫苗研发具有重要警示意义。
鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD）是危害全球家禽业的重大免疫抑制性疾病，其病原体传染性法氏囊病病毒（IBDV）自1957年发现以来不断演变。过去三十年，超强毒力IBDV（vvIBDV）导致的高死亡率曾是养禽业的主要威胁。随着疫苗的广泛使用，vvIBDV引起的急性死亡得到有效控制，但一种新的疾病形式——非典型IBD逐渐成为主导。非典型IBD不引起高死亡率，却会导致法氏囊严重萎缩和深度免疫抑制，显著增加鸡群对新城疫、禽流感等其他疾病的易感性，并严重削弱疫苗保护效果。近年来，中国及全球多个国家流行的非典型IBD主要由两种IBDV变异株引起：一是新变种IBDV（novel variant IBDV, nVarIBDV，基因型A2dB1），自2017年以来广泛传播，并能突破现有疫苗保护；二是突变超强毒株IBDV（mutated very virulent IBDV, mvvIBDV，基因型A3B3/A3B2），其基因组与vvIBDV高度同源，但VP2高变区（VP2-HVR）携带特征性突变（如A222T、G254D、I256L、D279N），致病谱发生改变，同样引起非典型IBD。自2023年以来，mvvIBDV在中国多个主要家禽养殖省份持续扩散。这两种毒株的共循环使得非典型IBD的防控形势日趋复杂。
尤为关键的是，IBDV作为一种双节段RNA病毒，其进化机制包括点突变、基因组重配和同源重组。当不同毒株共感染同一宿主时，病毒基因组在宿主细胞内共存，为基因片段交换（重配）或基因片段间的重组创造了条件，这可能催生具有新抗原性、增强的复制能力或致病性的流行株，对家禽业构成潜在威胁。因此，明确mvvIBDV和nVarIBDV这两种当前主要流行株是否能在自然条件下发生共感染，是评估其进化风险和制定有效防控策略的前提。然而，在此之前，这两种毒株自然共感染的可能性及其稳定性尚未得到证实。
为此，发表在《Poultry Science》上的这项研究，旨在探究mvvIBDV和nVarIBDV在自然条件下发生共感染的可能性，并评估其传播稳定性。研究人员通过RT-PCR、T载体克隆与测序、系统发育分析、病毒体内连续传代以及二代测序（NGS）等关键技术方法，对2023年从中国山东省一疑似IBD感染的白羽肉鸡场采集的法氏囊样本（编号IBDV-SD23-1903）进行了深入分析。SPF鸡来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽类实验动物资源中心。
Identification of distinct IBDV strains co-infecting a single bursa
研究人员首先对田间法氏囊样本（F0）进行RT-PCR检测，成功扩增出覆盖VP2高变区（VP2-HVR）的929 bp片段和覆盖VP1-B标记区的716 bp片段。直接对VP2-HVR的PCR产物进行Sanger测序时，发现测序色谱图在多个核苷酸位点出现重叠峰，提示样本中存在异质性病毒序列的混合感染。为解析混合感染，将RT-PCR产物克隆至T载体并进行测序。结果显示，从VP2-HVR扩增子中鉴定出两种不同的序列（F0-VP2-HVR-Clone-1和F0-VP2-HVR-Clone-2），它们核苷酸一致性为87.1%（435个位点中有56个差异位点）。同样，VP1-B标记区的克隆测序也揭示了两种高度差异的序列（F0-VP1-B-marker-Clone-1和F0-VP1-B-marker-Clone-2），核苷酸一致性为88.3%（429个位点中有50个差异位点）。所有核苷酸差异位点均与直接测序色谱图的重叠峰位置一致。
Characterization of the co-infecting strains as mvvIBDV and nVarIBDV
对克隆序列进行系统发育分析发现，F0-VP2-HVR-Clone-1的序列聚集在基因群A3（vvIBDV）内，但其VP2蛋白的17个特征性氨基酸位点分析显示，它含有四个独特的替换：A222T、G254D、I256L和D279N，这与mvvIBDV（基因型A3B3）的特征一致。而F0-VP2-HVR-Clone-2则属于A2d亚基因群（nVarIBDV），其氨基酸谱与A2dB1 nVarIBDV毒株完全相同。VP1-B标记区的系统发育分析表明，F0-VP1-B-marker-Clone-1属于基因群B3，含有特征性的145-TEG-147三肽 motif，与A3B3 vvIBDV毒株相同；F0-VP1-B-marker-Clone-2则属于基因群B1，含有145-NED-147三肽 motif，与A2dB1 nVarIBDV毒株匹配。这些结果明确鉴定出共感染的两个病毒株分别为mvvIBDV（A3B3）和nVarIBDV（A2dB1）。
Persistence of the co-infection upon serial passaging
为了探究共感染状态是短暂存在还是能够稳定维持，研究人员将原始法氏囊样本 homogenate（F0）在SPF鸡体内连续传代4次（F1-F4）。在每一代感染试验中，病毒感染均引起非典型IBD，鸡只无死亡和明显外观症状，但解剖发现法氏囊变黄、出现严重浆液性炎症渗出，病理切片观察显示法氏囊滤泡显著萎缩、间质增宽、B细胞数量显著减少。对F2和F4代法氏囊样本进行RT-PCR检测，直接测序VP2-HVR扩增子，其色谱图仍然呈现与F0样本相同的重叠峰模式，表明混合感染状态在体内传代过程中稳定存在，未发生毒株分离。进一步对F4代法氏囊样本进行二代测序（NGS）分析，确认样本中同时存在mvvIBDV（A-1/B-1片段）和nVarIBDV（A-2/B-2片段）的基因组。定量分析显示，mvvIBDV的A-1/B-1片段相对丰度较低，而nVarIBDV的A-2/B-2片段丰度较高，且同一病毒株的A、B片段丰度呈共波动趋势，提示样本中的病毒群体主要以完整的病毒粒子形式存在，未发生广泛的基因组重配。NGS获得的VP2-HVR和VP1-B-marker核苷酸序列与F0代T载体克隆的相应序列完全一致（100%同源性），进一步证实了共感染的稳定性。
研究结论与意义
本研究通过多层次分子证据链，首次提供了mvvIBDV和nVarIBDV在单一鸡只法氏囊内自然共感染的分子证据，并证实该共感染状态可在宿主间稳定传播。这一发现揭示了当前IBDV田间流行的复杂性，即mvvIBDV和nVarIBDV作为引起非典型IBD的两种主要病原，不仅共循环，还能够在个体宿主中持久共存。这种共存为病毒进化创造了温床，因为共感染是基因组重配和同源重组事件发生的前提。虽然本研究未检测到重配病毒基因型（如A3B1或A2dB3），但共存状态显著增加了产生新变异株的风险，这些新毒株可能兼具免疫逃逸能力和增强的复制力或致病性。
该研究结果对家禽非典型IBD的防控具有重要启示。首先，它强调了持续开展流行病学监测的必要性，特别是利用能够区分混合感染和识别重配病毒的技术（如本文采用的克隆测序和NGS）。其次，评估现有疫苗对mvvIBDV和nVarIBDV单一感染及共感染的保护效果至关重要。更重要的是，研究结果指出了开发新型防控策略的紧迫性，例如针对当前主要流行株（mvvIBDV和nVarIBDV）的抗原匹配疫苗，或者基于保守抗原的多价或广谱疫苗，以应对不断演变的病毒变异威胁。总之，这项研究不仅增进了对IBDV流行病学复杂性的理解，也为制定更精准的非典型IBD控制措施提供了关键科学依据。
