基于贝叶斯方法的噬菌体qPCR与液体培养技术在幼龄奶牛中早期检测副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）的应用
《Preventive Veterinary Medicine》：A Bayesian Analysis of Phage-based qPCR and Liquid Culture for the Early Detection of
Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis in Young Dairy Calves
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牛棒状杆菌副结核亚种（MAP）的早期诊断研究，通过比较Phage-Magnetic分离-qPCR与液态培养法，发现两者在感染个体中存在强负相关（相关系数-0.66），联合检测可使联合灵敏度达92%（95% PPI:53-100%），同时保持高特异性（97-100%），为犊牛早期诊断提供有效工具。
José M. Hernández-Agudelo | Cristóbal Verdugo | Herman W. Barkema | Pamela Steuer | Carlos Tejeda | Fernando Ulloa | Miguel A. Salgado
智利阿德莱安大学兽医学院预防兽医医学研究所传染病实验室，瓦尔迪维亚，智利
摘要
牛副结核病（PTB）由Mycobacterium avium 亚种paratuberculosis （MAP）引起，是一种地方性传染病，会导致显著的经济损失，感染通常发生在生命的最初几个月。然而，由于病原体的数量较少且排出具有间歇性，因此对亚临床感染犊牛的早期诊断具有挑战性，这限制了现有诊断工具的敏感性（Se ）。本研究旨在估计并比较噬菌体-磁分离（PhMS）qPCR检测方法与通过qPCR确认的液体培养方法在早期检测犊牛MAP感染方面的诊断敏感性（Se ）和特异性（Sp ）。我们使用贝叶斯潜在类别模型（BLCM）分析了来自智利39个商业牛群的528份60天以内犊牛的粪便样本，该模型考虑了条件依赖性。结果显示，这两种方法在MAP检测方面具有相似的中等敏感性（PhMS = 45%；培养 = 51%）和较高的特异性（PhMS = 98%；培养 = 100%）。然而，在MAP感染的动物中，这两种方法的检测结果呈强负相关（相关系数，ρDPhMS,Cult = -0.66；95%后验概率区间 [PPI]：-0.91至-0.12）。这种强负相关表明，这两种方法倾向于检测到不同的感染群体，当它们并行使用时可以互补，从而提高联合敏感性（Sej ）。估计的犊牛群体内平均真实患病率为13%（95% PPI：8–22%）。此外，在高患病率牛群中，PhMS-qPCR的特异性有所下降，这可能是由于病原体的被动排出。重要的是，通过利用它们的互补性，并行解读这两种方法可以获得92%的联合敏感性（95% PPI：53–100%），同时保持97%的特异性。总之，PhMS-qPCR和qPCR确认的液体培养方法是互补的诊断工具。将它们结合使用在并行检测策略中，可以提供一种高效的筛查算法，适用于旨在最大化病例检测的研究环境。
引言
副结核病（PTB），又称约翰病（JD），是由Mycobacterium avium 亚种paratuberculosis （MAP）引起的一种慢性进行性肉芽肿性肠炎。这种传染病在全球反刍动物中普遍存在，通过降低产量、提前淘汰和体重减轻给畜牧业带来重大经济损失（Rasmussen等人，2021年；Meles等人，2024年）。此外，MAP与人类炎症性疾病（如克罗恩病）之间的潜在关联强调了该病原体在“同一健康”（One Health）视角下的重要性，并突出了有效控制策略的必要性（Zarei-Kordshouli等人，2019年；Meles等人，2024年）。
PTB的流行病学很复杂，因为犊牛是最易感的年龄组，MAP感染通常通过粪-口途径在生命的最初几个月发生。尽管如此，成年后仍常观察到临床症状（Mortier等人，2015年）。此外，虽然控制计划传统上侧重于防止易感犊牛与排毒成年动物接触，但越来越多的证据表明，生命早期的暴露和犊牛之间的水平传播是群体内感染动态的关键因素（van Roermund等人，2007年；Corbett等人，2019年；Hernández-Agudelo等人，2025年）。因此，早期和准确地检测犊牛中的MAP是任何成功农场控制计划的基石。
在亚临床感染的年轻犊牛中诊断MAP感染具有挑战性。漫长的潜伏期加上低水平且间歇性的粪便排毒，大大降低了大多数可用诊断工具的敏感性（Se ）（Martins等人，2025年）。粪便样本的细菌培养长期以来被视为参考方法，因为它能够确认活MAP的存在（Nielsen和Toft，2008年）。然而，其实际应用受到细菌生长缓慢（可能需要几周时间）以及必要的严格化学去污程序的限制，这些程序会抑制竞争性微生物群，从而降低MAP的存活率（Reddacliff等人，2003年），进而降低检测的Se 。
直接分子技术，如定量PCR（qPCR），在速度上具有显著优势，但其可靠性严重依赖于所选择的遗传靶标。多拷贝插入序列IS900 被广泛用于提高MAP检测的Se ；然而，自从在其他非MAP分枝杆菌中发现了类似IS900 的序列以来，其特异性（Sp ）一直是一个长期存在的问题（Cousins等人，1999年；Englund等人，2002年），这一限制仍在系统中进行评估，并可能导致假阳性结果（Bissonnette等人，2024年）。此外，标准qPCR检测方法可能会受到粪便样本中常见PCR抑制剂（如复杂多糖和腐殖酸）的影响（Acharya等人，2017年），并且无法区分活菌和死菌，这对于准确评估MAP的传播风险至关重要。
为了解决这些限制，噬菌体-磁分离（PhMS）技术应运而生，它可以从复杂的样本基质中选择性地捕获活的分枝杆菌细胞，以便后续通过qPCR进行检测（Grant，2021年）。这种方法旨在结合培养（检测活细胞）和qPCR（快速检测）的主要优势，同时浓缩目标MAP细菌并去除潜在的PCR抑制剂（Foddai和Grant，2017年）。尽管PhMS-qPCR在复杂基质（如婴儿配方奶粉和生牛奶）中显示出潜力（Botsaris等人，2016年；Foddai和Grant，2020年），但其在自然感染犊牛粪便样本中的诊断性能尚未在实地水平得到验证。因此，本研究的目的是估计PhMS-qPCR在检测60天以下犊牛MAP感染方面的诊断Se 和Sp 。由于没有完美的金标准测试方法，因此采用了贝叶斯潜在类别建模方法来评估其性能。
材料与方法
本研究遵循了使用贝叶斯潜在类别模型（STARD-BLCM）的报告指南（Kostoulas等人，2017年）；完整的检查清单可在补充材料（补充文件S1）中找到。
研究样本和描述性测试结果
从最初的一组574份具有PhMS-qPCR结果的粪便样本中，有46份（8.0%）因液体培养过程中的微生物污染而被排除。因此，最终有528份具有有效配对结果的样本被纳入诊断性能评估。在这528份样本中，共有35份（6.6%，95%置信区间 [CI]：4.7 – 9.2%）通过PhMS-qPCR检测呈阳性，而40份（7.6%，95% CI：5.5 – 10.3%）通过qPCR确认的液体培养方法检测呈阳性。
讨论
本研究首次在多个牛群中验证了PhMS-qPCR检测方法与通过qPCR确认的液体培养方法在早期检测犊牛MAP感染方面的效果，同时考虑了两者之间的条件依赖性。我们的主要发现是，尽管PhMS-qPCR和液体培养方法的敏感性（Se ）中等，但在MAP感染的动物中，这两种方法的检测结果呈强负相关（( ρ PhMS Cult
未引用的参考文献
(O’Brien等人，2018年；Pazos-Rojas等人，2023年；Stan Development Team，2025年)
资助
本研究得到了智利国家研究与发展局（ANID）通过国家博士奖学金计划（2022年）的资助；ANID FONDECYT常规资助编号1240730；ANID FONDECYT启动资助编号11220481；以及洛斯里奥斯地区政府的创新竞争力基金（FIC）的资助（资助编号FIC 21-23）。
CRediT作者贡献声明
Hernández-Agudelo José Miguel： 写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，可视化，验证，项目管理，方法学，调查，数据分析，概念化。Cristóbal Verdugo： 写作 – 审稿与编辑，验证，监督，方法学，数据分析，概念化。Barkema Herman： 写作 – 审稿与编辑，监督。Pamela Steuer： 写作 – 审稿与编辑，方法学。Carlos Tejeda： 写作 – 审稿与
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利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本手稿中报告的工作。
致谢
作者感谢技术人员的宝贵实验室协助以及所有参与研究的农民的合作。我们特别感谢Francisco Jimenez、ángela Rendel和Mariana Alcoholado在商业农场中的关键支持，以及Juan Pablo Soto在野外工作和样本收集方面的帮助。我们还要感谢Rapid-Myco Technologies Limited（贝尔法斯特，北爱尔兰）的Irene Grant博士。
