多层接口发酵罐与吸附装置结合：应用于生物活性氮杂菲酮代谢物（+）-sclerotiorin的生产，使用菌种Penicillium sclerotiorum NBRC 113796

《Process Biochemistry》：Multistory interface fermentor coupled with an adsorption unit: Application to the production of a biologically active azaphilone metabolite, (+)-sclerotiorin, with Penicillium sclerotiorum NBRC 113796

多级接口发酵器耦合硅胶吸附单元高效生产(+)-sclerotiorin，通过溶剂分层和循环系统缓解反馈抑制，4周总产量达7.91克。

　　

奥田信信（Shinobu Oda）、熊崎福香（Fuka Kumazaki）、村上里子（Riko Murakami）、渡边良宏（Yoshihiro Watanabe）、岩月正人（Masato Iwatsuki）

金泽工业技术大学基因组生物技术实验室，日本石川县白山町Yatsukaho 3-1，邮编924-0838

摘要

我们构建了一种新型发酵系统——界面发酵器（Interface Fermentor，简称IFF），并将其应用于生产具有多种生物活性的真菌次级代谢产物（+）-sclerotiorin（SCL）。该系统由营养琼脂平板（底部相）、真菌菌垫（中间相）和疏水性有机溶剂（顶部相）组成。六个发酵器单元通过耐油橡胶管连接形成发酵塔。两个发酵塔与装有吸附剂颗粒（硅胶）的吸附单元并联连接。当其中一个单元中的有机溶剂（低密度二甲基硅油）溢出到下方单元时，两个底部单元中的溶剂也会溢出到吸附单元中。吸附单元中的溶剂通过循环泵被输送到每个发酵塔的头部单元。通过使用Penicillium sclerotiorum NBRC 113796菌株生产SCL，验证了这种多层IFF系统的有效性。该系统中共生产出了7.91克SCL。

引言

界面发酵器（IFF）是提取型液-固固定化（Extractive Liquid-Surface Immobilization，简称Ext-LSI）系统的改进版本，后者曾用于利用Trichoderma atroviride在液相与疏水性有机溶剂界面形成的微球层上发酵生产抗真菌芳香化合物6-pentyl-α-pyrone（6PP）[1]。在IFF系统中，液相被替换为琼脂平板。

研究表明，Ext-LSI系统具有实际应用价值的特点，例如通过原位提取细胞中的6PP来减轻反馈抑制[1]，以及解除碳代谢产物的抑制[2]。此外，向微球层中添加某些阴离子交换树脂颗粒可显著提高6PP的产量[3]，但这种树脂会显著抑制T. atroviride的孢子形成[3]。

Ext-LSI和IFF系统还被应用于新型真菌和放线菌的筛选[4][5]。与浸没培养相比，这些系统的次级代谢产物谱型有很大差异。因此，IFF在生产和许多疏水性有用代谢产物方面表现出更优的性能，亟需开发能够实现这些代谢产物工业化生产的IFF技术。

在本研究中，我们选择了一种有用的氮杂菲酮类代谢产物（+）-sclerotiorin（SCL）（化学式：[(7R)-5-chloro-3-[(1E,3E,5S)-3,5-dimethylhepta-1,3-dienyl]-7-methyl-6,8-dioxoisochromen-7-yl] acetate）作为IFF的目标化合物（图1）。SCL可由多种Penicillium、Cephalotheca、Chaetomium、Cochliobolus和Talaromyces属真菌产生[6][7][8][9][10][11]。SCL具有多种重要的药理活性[12]，如抗癌[8][13]、抗HIV[14]、抗结核[15][16][17]、抗真菌[14][19]、抗炎[20]、预防糖尿病并发症[18]和抗动脉硬化[21]作用。

目前，SCL的生产方法主要包括浸没培养[12][18]、静态液相培养[6][16][17]、固态培养[9][11]和琼脂平板培养[8]。然而，由于疏水性SCL难以从真菌细胞分泌到水相中，因此可能存在细胞内SCL积累导致的反馈抑制现象。

即使在固态和琼脂平板培养中，疏水性代谢产物也主要积聚在细胞内部和表面，从而阻碍SCL的大规模生产。因此，我们非常关注在IFF系统中是否能够像6PP那样，通过自然方式将代谢产物从细胞中提取到有机相中，从而缓解反馈抑制。

为此，我们构建了一个结合硅胶吸附单元的多层IFF系统，作为工业化生产SCL的原型。这种多层界面生物工艺已被应用于β-石竹烯向（–）-β-石竹烯氧化的微生物环氧化反应[22]，并进一步改进为上述IFF系统。实验结果表明，该系统在长期生产含有极性官能团的代谢产物方面具有极高的效率。

部分内容摘录

微生物与培养基

实验中使用的是Penicillium sclerotiorum NBRC 113796菌株。该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂上培养，并使用F-1液体培养基制备种子液。F-1培养基的成分包括：20.0克马铃薯淀粉、10.0克葡萄糖、20.0克大豆蛋白（Soypro?，日本大阪Inui公司）、1.0克KH₂PO₄和0.5克MgSO₄·7H₂O，培养基体积为1.0升，pH值为6.0。通过调整培养条件，可调控该菌株的形态为丝状生长。

结果与讨论

在界面培养系统中（包括界面生物反应器IBR和界面发酵器IFF），在水相（亲水性凝胶或液体培养基）与疏水性有机溶剂之间的界面上形成的生物膜或真菌菌垫被用作生物催化剂[1][2][3]。研究表明，在IFF系统中可高效生产杀菌性次级代谢产物6-pentyl-α-pyrone（6PP）。

CRediT作者贡献声明

岩月正人（Masato Iwatsuki）：项目监督。渡边良宏（Yoshihiro Watanabe）：撰写初稿、实验设计、数据整理。村上里子（Riko Murakami）：实验设计、数据整理。熊崎福香（Fuka Kumazaki）：实验设计、数据整理。奥田信信（Shinobu Oda）：撰写初稿、项目监督、方法学设计、资金申请、数据整理、概念构思。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在可能影响本研究结果的财务冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了大阪发酵研究所（Institute for Fermentation, Osaka，简称IFO）（2023年资助）和金泽涩谷科学与文化体育基金会（Shibuya Science Culture and Sports Foundation, Kanazawa，2022年及2023年资助）的支持。作者感谢金泽工业技术大学天然产物药物发现项目中的八位成员：安斋顺人（Shunto Anzai）、池村卓人（Takuto Ikemura）、泽谷纯之辅（Syunnosuke Sawatani）、吉田美波（Mihaya Yoshita）、本间樱（Sakura Yamada）、川本真野（Maino Kawamoto）和康尼美由（Miyu Konni）在技术上的协助。