基于序列可编程形态转换的肽-肽核酸杂化水凝胶及其在DNA数据存储中的应用

《Small Structures》：Peptide-Peptide Nucleic Acid Hybrid Hydrogel Based on Sequence Programmable Morphological Change for DNA Data Storage

本综述创新性地提出了一种基于肽核酸（PNA）诱导肽自组装形态转换的智能水凝胶构建策略。研究系统揭示了鸟嘌呤（Guanine）接枝数量对肽（FEFEFKFK）自组装行为（从纤维凝胶到纳米颗粒）的精准调控机制，并利用PNA-GG与PNA-CC的特异性碱基配对实现了生物正交的溶胶-凝胶转变。该水凝胶为DNA信息存储提供了温和的封装环境和优异的酶抗性保护，显著提升了合成DNA编码数据的存储稳定性和读取准确性，为智能生物材料设计开辟了新路径。

　　

2 结果与讨论

2.1 肽-PNA缀合物的合成

本研究选用八肽FEFEFKFK作为模型肽段，其序列由疏水苯丙氨酸残基（F）与带电荷的谷氨酸（E，负电）和赖氨酸（K，正电）交替排列，构成两亲性分子结构。该肽段可自组装形成反平行^β-折叠二级结构。通过固相肽合成法制备了一系列连接不同数量PNA-鸟嘌呤（PNA-G）的肽-PNA杂化分子：FEFEFKFK, G-FEFEFKFK, GG-FEFEFKFK, GGG-FEFEFKFK, GGGG-FEFEFKFK（依次缩写为PG₀, PG₁, PG₂, PG₃, PG₄）。产物均通过质谱分析进行了验证。

2.2 逐步鸟嘌呤缀合对肽自组装的调控

对PG₀至PG₄自组装行为的系统研究表明，PG₀在水中（20 mg/mL浓度下）可形成水凝胶。值得注意的是，PG₁, PG₃和PG₄保持了这种凝胶化倾向，而PG₂在相同条件下则保持溶胶状态。频率扫描分析显示，PG₀, PG₁, PG₃和PG₄表现出类固体凝胶的粘弹性特征（储能模量G′ > 损耗模量G″），而PG₂则显示出类液体响应（G″ > G′）。

原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）的纳米结构分析揭示了鸟嘌呤依赖的形态转变：PG₀, PG₃和PG₄自组装成微米级纤维，PG₁形成截短的纤维状结构，而PG₂则完全抑制了纤维形成，产生分散的球形纳米颗粒。观察到的纳米结构特征与宏观凝胶行为一致：形成纤维结构的样品（PG₀, PG₃, PG₄）表现出水凝胶形成，而组装成球形纳米颗粒的PG₂则不具备凝胶能力。

圆二色光谱（CD）和硫黄素T（Th T）荧光分析从分子水平阐明了观察到的自组装差异背后的构象变化。CD光谱显示，PG₀表现出典型的^β-折叠特征。PG₁中出现了额外的负峰，表明^β-折叠和无规卷曲构象共存。PG₂显示出^β-折叠特征消失，仅有一个宽的负带，证实了无规卷曲占主导。引人注目的是，PG₃和PG₄同时表现出^β-折叠峰和一个在260 nm处的显著负峰，这是反平行G-四链体折叠的特征。Th T荧光测定也证实了PG₃和PG₄中G-四链体的形成。

基于这些系统观察，我们提出鸟嘌呤依赖的转变源于竞争性的超分子驱动力，包括肽^β-折叠堆积、疏水相互作用和鸟嘌呤碱基^π-π堆积。在PG₀中，^β-折叠堆积占主导，驱动淀粉样纤维形成和凝胶化。引入单个PNA-G单元会缩短纤维长度，这可能是由于疏水和^π-π相互作用改变了杂化分子的二级结构并中断了纤维组装。对于PG₂，鸟嘌呤介导的疏水相互作用占主导，将自组装导向球形纳米颗粒。进一步增加鸟嘌呤则促进了G-四链体的形成，屏蔽了疏水核碱基，从而恢复了由肽段驱动的纤维组装。

2.3 PNA碱基配对诱导的溶胶-凝胶转变

上述研究表明鸟嘌呤核碱基的暴露状态对最终的超分子结构产生深远影响。受此现象启发，我们进一步探索了链杂交是否也能调控PG₂的组装。为此，合成了含有两个胞嘧啶的PNA（PNA-CC）并将其引入PG₂溶液中，以互补性地与GG片段结合。通过系统优化，确定了PG₂与CC之间形成稳定水凝胶的最佳条件为等摩尔比、浓度20 mg/mL、pH 5、温度25°C。PG₂和CC在10分钟内快速形成水凝胶（记为PG₂C₂）。流变学分析也支持了其水凝胶特性（G′ > G″）。TEM和AFM分析显示，虽然PG₂和PNA-CC的单个组分组装成纳米颗粒，但它们的组合体系生成了微米级纤维结构。CD光谱显示PG₂C₂在212 nm处出现一个负峰，对应于^β-折叠的再生，与PG₂的无规卷曲构象形成对比。这种形态变化被认为是由于CC-GG杂交屏蔽了鸟嘌呤核碱基，从而减弱了鸟嘌呤诱导的聚集，并增强了淀粉样肽驱动的纤维组装。这一特性非常适合开发肽水凝胶的生物正交溶胶-凝胶转变策略：前体PG₂稳定存在于溶液中，而添加PNA-CC可有效诱导凝胶化。该过程具有序列特异性、温和且生物相容性好的特点，非常适合包封敏感生物分子。

2.4 肽-PNA水凝胶增强DNA数据存储的稳定性

DNA因其非凡的信息密度和长寿命而具有作为档案存储介质的巨大潜力。然而，实现这一潜力需要开发先进的保护性材料，以防止在复杂环境中长期存放时序列降解并保持数据完整性。水凝胶由于其生物相容性和高DNA负载能力，已成为有前景的DNA保存候选材料。为了实现高效的DNA信息加载和回收，温和且生物正交的溶胶-凝胶转变是非常理想的。因此，我们进一步探索了我们的具有CC触发凝胶化特性的肽-PNA杂化水凝胶是否满足DNA数据存储的这些要求。

为“HELLO”、“CHEMISTRY”和“华中科技大学”（缩写为“HUST”）设计了DNA编码信息序列。我们在DNA片段的末端修饰了CC序列，并将所需的DNA信息预编码在PG₂溶液中。随后加入等摩尔量的互补PNA-CC序列以诱导凝胶形成，实现高效包封。CC触发的凝胶化过程非常温和，这也有利于掺入长链DNA序列而不损害其结构完整性。为了评估水凝胶对抗酶降解的保护效果，将DNase溶液施加于水凝胶表面并孵育过夜。去除DNase后，将水凝胶溶解于水中，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果表明，PG₂C₂水凝胶能有效屏蔽包封的DNA免受酶降解，而未受保护的DNA在相同条件下几乎完全降解。

为了评估该系统对更长DNA序列的处理能力，使用了双链“HUST”DNA。应用限制性内切酶预处理在dsDNA上产生CC结合位点，使其能够与PG₂特异性配对。将未经处理、缺乏CC粘性末端的dsDNA作为对照，以评估序列特异性加载效果。水凝胶形成后，在4°C下储存5天，然后用水彻底洗涤以去除解离的DNA片段。随后，水凝胶在搅拌下溶解于水溶液中。溶解后，最初掺入的DNA被稀释。取等分试样进行PCR扩增，以评估包封DNA的完整性和回收率。扩增结果显示，没有CC-PG₂配对的样品扩增微弱，而CC-PG₂配对系统则显示出稳健的扩增，证实序列特异性杂交显著增强了水凝胶内DNA信息的保留。因此，我们成功扩增了从PG₂C₂水凝胶中释放的DNA，获得了约220 bp的目标片段。此外，对该片段进行了测序，成功以100%的准确度解码了“华中科技大学”序列。

3 结论

总之，我们系统地研究了鸟嘌呤核碱基掺入对肽自组装形态的影响，建立了一种温和的肽水凝胶溶胶-凝胶转变策略。通过改变PNA-G的含量，调节了肽淀粉样纤维的组装：虽然PG₁, PG₃和PG₄在水溶液中保持纤维状结构，但PG₂在相同条件下优先形成纳米颗粒。最终的组装结构似乎由几种超分子驱动力之间的竞争所控制。^β-折叠淀粉样肽固有的成纤维倾向受到鸟嘌呤诱导的疏水塌陷的干扰，从而导致PG₁的纤维缩短和PG₂的纳米颗粒形成。随着鸟嘌呤数量的增加，G-四链体的形成削弱了鸟嘌呤核碱基之间的疏水相互作用，从而恢复了PG₃和PG₄中的纤维形成。基于这些见解，我们设计了一种肽-PNA杂化水凝胶系统，其前体PG₂为澄清溶液，但在添加PNA-CC后立即发生凝胶化。这种生物正交的溶胶-凝胶转变策略与敏感生物分子具有极好的兼容性，能够成功地将单链和双链DNA数据保存在水凝胶中。肽-PNA水凝胶上的PNA-GG粘性末端促进了序列选择性的DNA保留，而受保护的DNA信息可以通过水凝胶在纯水中溶解轻松回收。与利用双链DNA作为交联剂的传统DNA触发溶胶-凝胶转变不同，本研究提出了一种设计DNA基凝胶化过程的替代策略。该工作强调了核碱基驱动的构象变化在设计肽-核酸杂化物中的关键作用，并为肽水凝胶的温和溶胶-凝胶转变提供了一种通用方法，在包封敏感生物分子方面具有广泛的应用前景。