一种基于自荧光PS-NH2-BDC@Fe2O3纳米酶的双模式生物传感平台，用于超灵敏地定量赭曲霉毒素A

《Talanta》：A self-fluorescent PS-NH 2-BDC@Fe 2O 3 nanozyme-enabled dual-mode biosensing platform for ultrasensitive quantification of ochratoxin A

OTA高效检测方法与双模免疫传感平台设计 | 自荧光纳米酶 | 多色显色 | 比率荧光检测 | 黄曲霉毒素A检测

　　

陈梦婷|尹同月|杨玉明|朱洪水|刘英菊

中国三峡大学医学院与健康科学学院，国家中医药管理局中医药药理学（肿瘤学）三级实验室，宜昌443002，中国

摘要

开发高效可靠的检测策略，用于在复杂食品基质中识别赭曲霉毒素A（OTA）对于预防霉菌毒素相关疾病至关重要。本文成功构建了一种基于自荧光纳米酶的双模式免疫传感平台，用于超灵敏地检测OTA。通过一步水热法合成了一个用NH₂-BDC配体修饰的多孔球形Fe₂O₃纳米酶（PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃）。这种材料由于其独特的介孔结构和Fe²⁺/Fe³⁺氧化还原循环，不仅表现出高过氧化物酶（POD）样的活性，还具有自荧光特性，从而避免了外源性荧光团的引入。在竞争性免疫测定之后，该平台通过H₂O₂/TMB反应诱导金纳米棒（Au NRs）产生局域表面等离子体共振（LSPR）介导的多色变化，并结合了由牛血清白蛋白模板化的金纳米簇（BSA-Au NCs）和PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃-Ab₂构建的比率荧光系统，实现了OTA的双模式检测。所开发的免疫传感器具有0.001至10 μg/L的宽线性范围，检测限低至2.2×10^?4 μg/L。通过直观的多色可视化与自校准的双信号输出，这项工作为检测食品中的微量霉菌毒素提供了一种新颖且生物相容的传感策略。

引言

OTA被认为是毒性最强且分布最广的霉菌毒素之一，能够通过食物链在人体内积累，导致严重的肾毒性、肝毒性和免疫毒性[1]。由于其已被证实具有动物致癌性并对人类构成潜在危害，国际癌症研究机构将其归类为2B组致癌物[2]。为了应对这些严重的健康威胁，世界各地的监管机构对食品中的OTA制定了严格的最大残留限量（MRL）。例如，欧盟为原始谷物设定了低至5.0 μg/kg的MRL，为葡萄酒设定了2.0 μg/kg的MRL[2,3]。鉴于严格的食品安全法规和人类健康的重要性，迫切需要高度敏感和准确的检测方法来有效监测和控制OTA污染。近年来，人们投入了大量努力来开发能够满足这些监管要求的先进检测平台。尽管高效液相色谱（HPLC）等传统方法具有可靠的性能，但其繁琐的操作程序和对复杂仪器的依赖性常常限制了它们的广泛应用[4]。

基于抗原-抗体相互作用的免疫传感器在食品、生物和环境检测中得到了广泛应用，因为它们具有高特异性和快速响应的优点[5]。其中，比色免疫传感器因其操作简单、易于使用而受到更多关注[6]。大多数比色免疫测定通过催化底物产生单色变化来实现目标检测。例如，朱等人使用Cu₂O催化无色的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色的TMB⁺，从而构建了一种用于视觉检测OTA的比色免疫传感器[7]。然而，肉眼难以区分单色变化[8]。相比之下，利用纳米颗粒作为显色底物的比色免疫测定可以通过调节纳米颗粒的大小[9]、形状[10]或组成[11]来展示出色的光学特性和局域表面等离子体共振（LSPR）效应，从而实现宏观可观察的多色变化。这些优势为食品安全领域的此类检测方法提供了广泛的应用前景。例如，尹等人使用金纳米棒（Au NRs）作为显色底物和TMB²⁺作为蚀刻剂，实现了食品中有机磷农药的多色视觉检测[12]。通过将TMB的单色变化转化为基于Au NRs的多色变化，该策略不仅实现了肉眼可见的目标检测，还通过UV-Vis吸收光谱的明显变化实现了定量检测。尽管单模式检测方法在便利性或灵敏度方面各有优势，但其结果容易受到环境干扰且缺乏自我验证能力，这限制了它们在复杂实际样品中的可靠应用。相比之下，多模式检测策略通过整合互补的信号输出显著增强了分析的稳健性，克服了这一限制。例如，光电荧光双模式传感器的制备结合机器学习算法，促进了多维信号的协同分析和高精度量化，从而显著提高了检测准确性和信息维度[13]。此外，将材料级信号放大与便携式设备和智能算法相结合，可以将多模态系统推向即时诊断[14]。在这些策略中，比率荧光方法可以通过内置的环境校准来规避背景干扰，实现痕量目标的检测。在这一方向上，将多色比色信号与比率荧光信号相结合，不仅继承了多模态交叉验证的可靠性优势，还集成了快速可视化和高精度量化。这种方法为开发结合了现场友好操作和实验室级准确性的下一代即时检测工具提供了可行的途径。

纳米酶的催化活性是基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的免疫传感器性能的基础。尽管广泛使用的磁性纳米颗粒（如Fe₃O₄）显示出潜力，但其应用受到化学不稳定性和潜在毒性的限制。此外，它们的催化过程通常需要高温激活，这容易导致生物分子的变性，严重限制了它们在生物传感中的应用[15,16]。为了解决这些限制，介孔Fe₂O₃纳米颗粒作为一种有效的解决方案应运而生。通过精确的形态工程，这些纳米颗粒实现了高比表面积和更多的暴露活性位点，即使在室温下也能表现出增强的POD样活性，为在温和条件下进行高效生物检测奠定了坚实的基础[17],[18],[19]。在此基础上，将溶剂衍生的荧光配体与介孔Fe₂O₃结合，可以构建高性能的自荧光纳米酶。这种创新设计不仅保留了介孔结构固有的高催化效率以及磁性颗粒提供的易于分离和回收的实际优势[20,21]，还赋予了稳定的内在荧光，实现了催化过程和信号输出的实时监测。与传统的量子点或有机荧光团相比，这种无机荧光探针具有更优异的光稳定性和低生物毒性[22]。关键的是，在合成过程中，有机配体在纳米颗粒之间提供的空间位阻有效地抑制了热处理过程中的颗粒聚集，确保了材料结构的均匀性和稳定性[23]。最终，这种自荧光介孔Fe₂O₃纳米酶实现了高效室温催化、方便的磁性分离和稳定的光学信号传递的集成功能，为在复杂生物基质中实现高灵敏度和稳定的检测提供了新途径。

在这项研究中，构建了一种结合多色比色和比率荧光的双模式免疫传感器，用于超灵敏地检测OTA。具体来说，通过改变溶剂和反应温度，通过一步水热法合成了具有定制孔结构和丰富Fe³⁺/Fe²⁺氧化还原对的PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃纳米酶。相互连接的孔结构促进了底物（TMB/H₂O₂）的有效质量扩散，而快速的Fe³⁺/Fe²⁺循环加速了通过类芬顿途径生成羟基自由基（·OH），从而实现了卓越的POD样活性。Au NRs和BSA-Au NCs分别用作比色探针和荧光参考。在免疫反应过程中，PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃-Ab₂催化了H₂O₂介导的TMB氧化为TMB²⁺，这蚀刻了Au NRs并改变了它们的长宽比，实现了OTA的视觉检测。同时，生成的·OH淬灭了BSA-Au NCs的620 nm发射，实现了具有内置校准的比率荧光检测（F₆₂₀/F₄₄₅）。通过整合这两种双信号模式，免疫传感器实现了OTA的交叉验证检测，提高了检测精度。

仪器和材料

本研究中使用的仪器和材料详细信息见补充材料的第一部分。

PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃纳米酶的制备

首先，将0.16克Pluronic F127溶解在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（13.34毫升）中。然后，将0.4 M FeCl₃·6H₂O（0.66毫摩尔，1.66毫升）水溶液倒入表面活性剂溶液中。搅拌1小时后，加入0.3毫升CH₃COOH溶液。接着，在搅拌1小时后，加入60毫克（0.33毫摩尔）2-氨基对苯二甲酸（NH₂-BDC）。随后，继续搅拌

多色比色-比率荧光双模式免疫传感器的原理

PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃-Ab₂是通过PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃上的氨基与Ab₂上的羧基之间的共价结合成功合成的。PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃的FTIR光谱（图S1A）在550 cm^?1、1024 cm^?1和1552 cm^?1处显示出特征峰，分别对应于Fe-O键、C-O键和N-H弯曲振动[24]。3417 cm^?1

结论

本文构建了一种新型的双模式免疫传感平台，通过合理设计的PS-NH₂-BDC@Fe₂O₃纳米酶实现了OTA的灵敏和可视化检测。该平台将高效的Fe²⁺/Fe³⁺氧化还原循环驱动的增强POD样活性与内在荧光特性在单一纳米材料中协同整合，实现了独立且互补的双信号输出。在比色检测模式下，纳米酶催化TMB氧化为TMB²⁺

CRediT作者贡献声明

陈梦婷：撰写——原始草稿、方法学、研究、形式分析。尹同月：方法学、研究、形式分析。杨玉明：方法学、研究。朱洪水：方法学、研究。刘英菊：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了湖北省自然科学基金（2025AFB131）和中国三峡大学的高层次人才研究启动基金（N202460003440006）的支持。