《Fermentation》：Fermentation-Induced Changes in Nutritional, Antinutritional, and Microbial Characteristics of Calabash Fruit (Crescentia cujete L.) Seeds
引言
青枣（Ziziphus mauritiana Lam.），又称印度枣，在中国南方广泛种植，其果实具有重要的经济价值。然而，果实采收后，为促进来年新梢生长和果实产量与质量，通常会对枝条进行修剪，产生大量废弃的枝叶。当地农民常采用露天焚烧的方式处理这些生物质，这不仅造成严重的空气污染，也是对宝贵资源的浪费。因此，迫切需要开发高效、便捷的技术来处理青枣秸秆，以实现农业废弃物的资源化利用。
与玉米、水稻等主要作物的秸秆相比，青枣秸秆主要由木质纤维素组成，结构复杂，养分可利用性低，这些特性严重限制了其直接作为动物饲料的应用。现有研究更多关注其叶片和树皮中的药用生物活性化合物，揭示了其显著的抗氧化和抗炎潜力，但关于其秸秆饲用价值的研究仍较缺乏。
微生物发酵技术是利用这类木质纤维素资源的关键途径。微生物发酵被广泛认为是一种有效且环保的将秸秆转化为饲料的策略。通过微生物活动，秸秆中的木质素、纤维素和半纤维素等复杂碳水化合物可以被降解，从而提高营养物质的消化率和生物利用度。此外，发酵还能减少抗营养因子，并产生多种有益代谢产物，包括益生菌、酶、有机酸、维生素和小分子肽，这些对动物的生长性能、肠道健康和免疫功能具有积极影响。常用的发酵菌种，如乳酸菌（Lactobacillus）、芽孢杆菌（Bacillus）和酵母菌，在发酵过程中发挥着产酸、分泌降解纤维的酶以及营养强化等多重作用。越来越多的研究倾向于使用复合微生物菌剂，利用菌株间的协同作用，实现更全面、高效的底物降解和功能改善。研究证实，使用复合菌剂对玉米秸秆进行固态发酵或青贮，能有效提高粗蛋白含量并降低纤维组分。水稻秸秆的发酵优化了牲畜胃肠道内的微生物状态和能量代谢，从而改善了生长性能和肉品质。棉籽粕发酵后，游离棉酚降低了85.63%，小肽含量增加至46.25%。对小麦、高粱、大豆等副产物的研究也表明，适当的菌种组合和发酵工艺能显著提升这些农业废弃物的饲用价值。同样，对香蕉、柑橘、苹果、桑葚、葡萄等水果副产物的广泛研究也证明，微生物发酵能产生包括益生元、有机酸和多酚在内的一系列化合物，显著提高了发酵产品的饲料价值。对枣（Ziziphus jujuba Mill.）的研究也证实发酵能显著增强枣副产物的饲用价值。
然而，利用果树修剪的茎、枝、叶作为发酵原料以改善其饲用价值的研究仍然相对有限。此外，尽管现有研究在改善发酵饲料营养表型方面积累了大量数据，但对于驱动这些变化的潜在机制，特别是发酵过程中微生物群落的动态演变、功能基因转移和系统代谢重编程，仍缺乏全面深入的理解。这种机制认知的空白阻碍了发酵工艺的进一步优化和高效靶向微生物菌剂的开发。
因此，本研究聚焦于未被充分利用的青枣秸秆，采用整合的宏基因组学和代谢组学分析方法，系统研究了固态微生物发酵对其营养品质的影响，并旨在阐明发酵过程中发生的微生物和代谢变化，为青枣秸秆的有效利用提供坚实的理论基础。
材料与方法
试剂与材料
青枣秸秆采自中国国家闽台特色作物种质资源圃（福建漳州）。青枣的茎和枝在果实采收后进行修剪。用于菌株培养的de Man, Rogosa Sharpe (MRS)肉汤和Luria–Bertani (LB)肉汤购自Hope Bio-Technology（中国青岛）。用于制备无菌盐水和发酵盐水的氯化钠（NaCl, ≥99.5%，分析纯）购自Sigma-Aldrich（中国上海）。宏基因组测序的基因组DNA提取使用E.Z.N.A.?DNA Kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA）。宏基因组文库构建使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit（Illumina, San Diego, CA, USA）。用于凝胶电泳的琼脂糖（分子生物学级）购自BioFroxx（中国杭州）。用于代谢物提取和LC-MS分析的甲醇（质谱级）和甲酸（质谱级）购自Thermo Fisher Scientific（中国上海）。乙酸铵（质谱级）购自Sigma-Aldrich（中国上海）。所有其他使用的化学品和溶剂均为分析纯。
发酵青枣秸秆的制备
菌株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC-1、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PC-2（从西藏泡菜中分离）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）TR-1、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）TR-2（从新疆土壤中分离）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）ZLP-1（从印度尼西亚棕榈粕中分离）通过本实验室基于产酸和纤维素酶活性的分离、鉴定和筛选获得。所有菌株在各自特定的培养基（植物乳杆菌PC-1用MRS液体培养基，芽孢杆菌菌株PC-2、TR-1、TR-2和ZLP-1用LB液体培养基）中于37°C培养24小时，然后转接至新鲜培养基中于30°C培养12小时。种子液在8000 rpm、4°C下离心2分钟，用0.85%（w/v）无菌盐水洗涤两次，并调整浓度至107CFU/mL备用。随后，将五种菌的菌悬液按1:1体积比混合，制备复合微生物菌剂。
果实采收后，收集青枣秸秆，干燥，用粉碎机研磨成粉末，过80目筛。将秸秆粉末均匀分装到发酵袋中，按15%（w/v，1 kg秸秆粉末接种150 mL混合菌悬液）的接种量接种上述复合微生物菌剂。最后，用便携式水分测定仪测得秸秆粉末水分含量约为20%，用便携式pH计测得pH值在5.40至4.00之间。将发酵袋密封后置于37°C恒温培养箱中发酵4天，得到发酵青枣秸秆（T）。对照组（CK）在相同条件下但不接菌处理。发酵第4天，取样5 g材料（n = 3）用于后续宏基因组测序和非靶向代谢组学分析。
粗蛋白和纤维组分的测定
粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定。纤维组分，包括中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）和酸性洗涤木质素（ADL），使用ANKOM 220纤维分析仪（ANKOM Technology, Macedon, NY, USA）按照范苏斯特（Van Soest）方法的标准程序进行分析。
微生物DNA提取与宏基因组测序
使用E.Z.N.A.?DNA Kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA）根据制造商方案从青枣秸秆样品中提取微生物基因组DNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA）评估提取DNA的浓度和纯度。通过1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进一步验证DNA完整性。合格的DNA样品在文库构建前储存于-80°C。使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit（Illumina, San Diego, CA, USA）制备测序文库，并在Illumina HiSeq平台上进行双末端测序（150 bp）。
序列数据处理、组装和基因预测
使用Trimmomatic（v0.39）对原始测序读段进行初步处理，去除接头序列和低质量碱基。将得到的高质量清洁读段使用BWA（v0.7.17）比对到宿主基因组，以识别并去除宿主来源的序列。使用MEGAHIT（v1.2.9）在默认参数下对去除宿主后的宏基因组读段进行从头组装，生成重叠群（contigs）。使用META Prodigal（v2.6.3）从组装的重叠群中预测基因。通过CD-HIT以95%序列一致性和90%覆盖度为阈值聚类所有预测的蛋白质序列，构建非冗余基因目录。
分类学与功能注释
通过将非冗余基因集与NCBI NR数据库使用BLASTP（v2.10.0）进行比对，实现分类学分析，并基于最低共同祖先算法进行分类学分配。对于功能表征，将蛋白质序列注释到多个数据库：通过eggNOG注释到直系同源簇（COG）数据库；使用KofamScan（v1.3.0）注释到京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库；使用HMMER（v3.3.2）注释到碳水化合物活性酶（CAZy）数据库；注释到结构化抗生素抗性基因（SARG）数据库和毒力因子数据库（VFDB）。使用DIAMOND（v2.1.8）进行序列比较，e值截断值为1×10?5。通过使用Salmon（v1.10.2）将质量控制的读段映射回非冗余基因目录，生成分类群和功能基因的丰度谱。
样品内微生物群落多样性（α多样性）通过计算Chao1和Shannon指数进行评估。样品组间微生物群落结构差异（β多样性）基于Bray-Curtis相异矩阵进行评估，并使用主成分分析（PCA）进行可视化。所有统计分析和可视化均使用R软件（v4.5.2）及相应的包进行。
样品制备与代谢物提取
共分析了来自对照组（CK, n = 3）和微生物发酵组（T, n = 3）青枣秸秆的六个样品。使用80%甲醇水溶液提取代谢物。简要步骤如下：将100 mg样品在液氮中匀浆，与500 μL提取溶剂混合，冰上孵育5分钟。在15,000× g、4°C下离心20分钟后，收集上清液，并用质谱级水稀释至最终甲醇浓度为53%。提取物在相同条件下再次离心，所得上清液用于液相色谱-质谱（LC-MS）分析。
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析
代谢物分析使用超高效液相色谱系统（Vanquish UHPLC, Thermo Fisher）耦合高分辨率质谱仪（Q ExactiveTMHF-X, Thermo Fisher）进行。色谱分离在40°C恒温的Hypersil Gold C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm, 1.9 μm）上实现。流动相组成：正离子模式下为（A）含0.1%甲酸的水和（B）甲醇；负离子模式下为（A）5 mM乙酸铵（pH 9.0）和（B）甲醇。梯度洗脱程序如下：0–1.5分钟，2% B；1.5–3.0分钟，2–85% B；3.0–10.0分钟，85–100% B；10.0–10.1分钟，2–100% B；10.1–12.0分钟，2% B。流速为0.2 mL/min。质谱分析参数：喷雾电压3.5 kV，鞘气流速35 psi，辅助气流速10 L/min，毛细管温度320°C，辅助气体加热器温度350°C。全扫描范围m/z 100至1500，并进行数据依赖性MS/MS扫描以鉴定代谢物。
使用CD 3.1软件处理原始数据，进行峰提取、对齐，并针对HMDB、KEGG和LIPID MAPS数据库进行注释。在没有标准品的情况下，这些鉴定结果被视为推定性的（对应于代谢组学标准倡议置信度2级）。在整个分析过程中穿插质控（QC）样品以确保数据稳定性，并在QC中变异系数（CV）> 30%的代谢物被过滤掉。应用多变量统计分析，包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘-判别分析（PLS-DA），来建模组间分离并识别差异代谢物。满足倍数变化（FC）> 2、变量重要性投影（VIP）> 1且p值 < 0.05（t检验）的代谢物被视为显著变化的代谢物。通过KEGG通路富集分析进行功能解读。
统计分析
数据以三个生物学重复的平均值±标准差（SD）表示。使用SPSS 26.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）中的Student t检验和Benjamini and Hochberg FDR校正法确定CK组和T组之间差异的统计学显著性，显著性水平设定为Padj< 0.05。所有数据的图形展示均使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）生成。
结果
青枣秸秆固态发酵过程中的化学组成与营养品质
如表1所示，青枣秸秆的微生物发酵通过增加粗蛋白含量和降低特定纤维组分显著改善了其营养价值。与CK组相比，T组粗蛋白含量显著增加（Padj< 0.05）。同时，T组的中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）和纤维素含量显著降低（Padj< 0.05）。然而，两组之间在酸性洗涤木质素（ADL）和半纤维素含量方面未发现显著差异（p > 0.05）。
宏基因组数据概览
CK组和T组的宏基因组测序和组装统计信息总结在表2中。所有六个样品共产生超过4.23亿条原始读段。经过严格质量控制后，获得超过4.03亿条清洁读段用于后续组装。三个CK重复的清洁读段组装成平均54,752个重叠群，平均长度为4980万bp，而三个T重复产生平均46,717个重叠群，平均长度显著增加至5390万bp。共预测出371,219个开放阅读框（ORFs），T组的平均ORF长度（458 bp）明显长于CK组（379 bp）。该综合数据集为后续有关微生物发酵过程的功能基因分析奠定了可靠基础。
分类学注释
CK组和T组微生物群落的组成如图1所示。主成分分析（PCA）显示CK组和T组沿第一主成分（PC1）明显分离，PC1解释了总方差的41.76%，表明微生物发酵过程显著改变了微生物群落结构（图1A）。使用Chao1（丰富度）和Shannon（多样性）指数评估显示，相对于CK组，T组的这两个指标均显著降低（Padj< 0.05）（图1B, C）。
微生物发酵过程引起了青枣秸秆细菌和真菌群落结构的显著且一致的变化。如图1D所示，细菌群落在门水平上表现出明显的 consolidation，假单胞菌门（Pseudomonadota）从CK组的90.82%增加到T组的97.01%。伴随着这一变化，酸杆菌门（Acidobacteriota）相应减少（从CK到T，从6.23%降至0.02%），而芽孢杆菌门（Bacillota）的相对丰度有所增加（从1.82%增至2.35%）。这种结构重组在属水平上得以保持（图1E），克雷伯菌属（Klebsiella）（24.44%至30.88%）、肠杆菌属（Enterobacter）（20.26%至29.97%）和Robertmurraya（1.75%至2.09%）的相对丰度增加。相反，泛菌属（Pantoea）（14.25%至9.44%）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）（2.73%至1.74%）和Terriglobus（4.01%至0.01%）的丰度下降。物种水平的数据证实了这一趋势（图1F），密歇根克雷伯菌（Klebsiella michiganensis）（18.37%至22.94%）和桑肠杆菌（Enterobacter mori）（9.11%至13.92%）增加，而Pantoea anthophila（12.18%至7.93%）和Terriglobus sp903642225（2.14%至0.004%）显著下降。
相比之下，真菌群落表现出不同但同样一致的反应。在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）从95.47%减少到91.19%，而担子菌门（Basidiomycota）从4.14%增加到8.10%。其他次要门，包括毛霉门（Mucoromycota）（从CK到T，从0.21%增至0.33%）和捕虫霉门（Zoopagomycota）（0.003%至0.015%）在发酵后也显示出丰度增加（图1G）。这一变化在属水平上也很明显，优势属短梗霉属（Aureobasidium）从69.80%下降到64.92%，而Astraeus从1.71%增加到4.84%。其他属，包括镰刀菌属（Fusarium）（1.35%至1.57%）、Monosporascus（1.04%至1.80%）和柄锈菌属（Puccinia）（0.96%至1.55%）也显示出丰度增加（图1H）。物种水平分析反映了这些变化，产黑短梗霉（Aureobasidium melanogenum）从50.43%下降到47.34%，而Astraeus odoratus从1.71%增加到4.84%，条形柄锈菌（Puccinia striiformis）从0.96%增加到1.55%（图1I）。
这些跨分类水平的协调变化表明，微生物发酵持续地重塑了微生物生态系统，在细菌和真菌群落中产生了明显且互补的结构变化。
功能注释
对青枣秸秆中微生物群落的功能潜力进行了分析，以评估微生物发酵的影响。
碳水化合物活性酶（CAZy）
CK组和T组之间的CAZy谱总体一致（图2A）。主要家族的相对丰度未观察到显著差异，包括糖苷水解酶（GH: CK 1639.74 ± 146.82 vs. T 1662.37 ± 648.21）、糖基转移酶（GT: CK 1192.89 ± 170.66 vs. T 1206.82 ± 410.86）和碳水化合物酯酶（CE: CK 119.16 ± 11.36 vs. T 126.92 ± 45.56）。这表明发酵后植物多糖解构的整体功能能力得以保留。
直系同源簇（COG）
基于COG数据库的功能注释如图2B所示。发酵过程引发了遗传信息处理和代谢方面的明显变化。观察到与转录（类别 K: T 12,410.35 ± 2310.47 vs. CK 11,922.91 ± 733.07）以及复制、重组和修复（类别 L: T 24,572.31 ± 1106.76 vs. CK 22,744.13 ± 541.67）相关的功能增加。相反，RNA加工和修饰（类别 A: T 282.73 ± 12.16 vs. CK 395.85 ± 18.89）以及核结构（类别 Y: T 13.28 ± 4.60 vs. CK 30.52 ± 5.28）显著减少（Padj< 0.05）。在中心代谢方面，观察到辅酶运输和代谢（类别 H: T 9658.68 ± 1361.88 vs. CK 9035.20 ± 265.26）增加，而碳水化合物运输和代谢（类别 G: T 7969.37 ± 2787.10 vs. CK 8550.67 ± 763.41）以及氨基酸运输和代谢（类别 E: T 9837.00 ± 2506.90 vs. CK 10,325.99 ± 902.95）则出现减少。
KEGG通路分析
在最广泛的功能水平（Level 1，图2C）上，基因分配到主要类别中的总体分布基本稳定。最丰富的类别——代谢，在T组（15,005.75 ± 5332.48）和CK组（14,883.06 ± 1866.30）之间显示出可比的丰度。类似地，环境信息处理（T 6324.80 ± 2377.58 vs. CK 6148.96 ± 1009.34）和遗传信息处理（T 3189.52 ± 1115.28 vs. CK 3230.57 ± 268.69）保持一致。在Level 2（图2D），膜转运（T 3819.16 ± 1527.18 vs. CK 3584.67 ± 649.99）和碳水化合物代谢（T 4794.50 ± 1823.27 vs. CK 4651.79 ± 657.69）的通路在发酵后略有富集。相比之下，能量代谢（T 2754.47 ± 855.70 vs. CK 2867.95 ± 315.87）和细胞运动（T 764.09 ± 308.16 vs. CK 868.38 ± 107.85）呈下降趋势。Level 3的详细视图证实了T组中特定转运和代谢通路的富集，包括ABC转运蛋白（T 2641.04 ± 1034.33 vs. CK 2524.00 ± 472.84）、碳代谢（T 1727.06 ± 631.97 vs. CK 1664.12 ± 225.99）以及淀粉和蔗糖代谢（T 774.22 ± 314.85 vs. CK 706.19 ± 97.45）。值得注意的是，氧化磷酸化通路在T组（965.22 ± 176.24）低于CK组（1164.94 ± 78.25）（图2E）。
总之，功能谱表明微生物发酵重塑了微生物群落的代谢策略，增强了特定转运系统和碳水化合物利用途径的能力，同时减少了对氧化磷酸化等能量密集型过程的投入，反映了对发酵环境的适应。
抗生素抗性基因（ARGs）
抗生素抗性基因（ARGs）的分析表明，T组的ARGs丰度可能呈减少趋势。如图3A总结，总ARG丰度在T组呈较低趋势。赋予多重耐药性的基因（最主要的类别）的丰度在T组（429.91 ± 210.74）低于CK组（493.19 ± 86.34）。其他几个主要类别也观察到类似的丰度降低趋势，包括多粘菌素（CK: 77.40 ± 17.40 vs. T: 71.28 ± 33.65）、MLS（大环内酯-林可酰胺-链阳菌素类
