《Fermentation》：Enhanced Cultivation of Actinomycetota Strains from Millipedes (Diplopoda) Using a Helper Strain-Assisted Method
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本研究创新性地采用辅助菌株（helper strain）共培养技术，通过添加辅助菌株发酵上清液成功从马陆样本中分离出143种放线菌（Actinomycetota），其中49种为新物种。该方法使放线菌分离种类提升3.5倍，并发现菌株N8-31携带40个生物合成基因簇（BGCs），60%具有新颖性，为抗生素开发提供重要资源。
辅助菌株候选株的初步筛选
通过双层平板法评估29株候选辅助菌株与8株模式菌株（4株放线菌+4株其他门类）的相互作用。实验观察到30个正向生长促进作用，其中16株候选菌对模式菌株产生明显生长圈（halo）现象。15株对放线菌模式株（K1、K2、K3、TA8）具促生作用的菌株被选入后续验证实验，仅M12株对非放线菌特异促生。
生长促进效应的定量验证
采用菌落形成单位（CFU）计数法比较添加辅助菌株上清液培养基与对照培养基的菌落形成效率。8株辅助菌株（M3、M9、M13、N3、N4、N6、N8、N9）使目标菌株CFU提升≥1.5倍，其发酵上清液被用于后续马陆样本培养实验。
基于辅助菌株上清液的放线菌多样性强化培养
将筛选获得的8株辅助菌株上清液按1%（v/v）添加至稀释R2A培养基用于马陆样本细菌分离。实验组获得233个细菌物种（OTUs），含72个新物种；对照组仅获得42个OTUs（11个新种）。针对放线菌的特异性分析显示，实验组分离到143个放线菌OTUs（49个新种），对照组仅为29个OTUs（8个新种）。16S rRNA基因多样性比较表明，实验组覆盖85个属（占环境样本总属水平的50%），对照组仅覆盖24个属（14%）。
活性放线菌株的抗菌功能筛选
通过PSMPA平台预测75株放线菌（含67株实验组菌株）的生物合成基因簇（BGCs）数量，筛选高BGCs数量或疑似新物种的菌株进行抗菌实验。14株（18.7%）对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或大肠杆菌（Escherichia coli）等指示菌产生抑制活性。
高潜力新菌株N8-31的基因组解析
对抗菌活性显著的疑似新菌株Streptomyces sp. N8-31进行全基因组测序。CARD数据库注释显示134个抗生素抗性基因，主要涉及抗生素外排（66基因）和靶标修饰（55基因）机制。antiSMASH分析预测40个BGCs，其中60%与已知簇相似性<70%（20个簇相似性<50%），包含非核糖体肽（NRPS）、I型聚酮合酶（T1PKS）、萜类等多样类型，其中区域20（核苷类）和区域21（T1PKS）与已知抗生素簇相似性分别仅为0%和4%。
讨论与展望
研究证实辅助菌株分泌的代谢物可有效模拟微生物互作环境，突破传统培养限制。尽管成功分离大量放线菌，但环境样本中高丰度的Bdellovibrionota门和Epsilonproteobacteria类群仍未获得纯培养，提示其生长可能依赖更特异的环境因子。菌株N8-31展现的丰富BGCs资源为新型抗生素开发提供重要线索，后续需通过HPLC-MS分离活性成分并结合基因敲除验证生物合成途径。
