《Dairy》：Unraveling Jawbone Susceptibility: Distinctive Features Underlying Medication-Related Osteonecrosis
摘要
背景/目的：干槽症（alveolitis）是拔牙后常见的并发症，以疼痛、炎症和愈合延迟为特征。标准外科治疗常具侵入性且效果有限。激光疗法具有抗菌、抗炎和促进再生的作用。本研究旨在比较980 nm单激光疗法与980 nm及1550 nm双波长疗法对兔模型牙槽窝愈合的影响。
方法：体外测试评估980 nm激光照射的杀菌效果。18只成年雄性青紫蓝兔拔除第一切牙并防止血凝块形成以模拟干槽症愈合模型。第3天，动物随机分为三组：机械刮治加 antiseptic irrigation、980 nm 二极管激光治疗或联合980 nm + 1550 nm治疗。临床参数（充血、水肿、疼痛、牙槽窝闭合）评估至第7天。组织学和微生物学分析在第7天和第12天进行。
结果：激光疗法效果优于机械治疗。体外实验中，980 nm照射3秒后可根除微生物。至第7天，双激光组充血评分降至0.7 ± 0.6分，而单激光组为2.0 ± 0.0分，机械治疗组为3.0 ± 0.0分。双激光组67%的位点实现完全牙槽窝闭合，而机械治疗组仅为33%。仅双激光治疗后疼痛完全缓解。组织学证实双激光组肉芽组织更有序且血管生成更活跃。
结论：双波长激光疗法在抗炎、抗菌和促进再生方面优于单激光疗法和机械治疗，凸显其作为干槽症微创治疗方法的潜力，值得进一步临床评估。
1. 引言
干槽症，或称“干槽症”，是拔牙后最常见且痛苦的并发症之一。其发病机制与牙槽窝内血凝块形成受阻及随后崩解有关，导致骨壁暴露并引发剧烈炎症。该病患病率在常规拔牙后为0.5%至5%，在下颌阻生第三磨牙拔除后可达30%或更高，显著降低患者生活质量并延长康复时间。
干槽症的标准治疗方案包括刮治牙槽窝以清除坏死组织、 antiseptic 溶液冲洗以及局部应用抗炎和抗菌药物。尽管广泛应用，这些方法存在显著局限性：具侵入性、不能完全根除病原微生物、且不刺激主动再生过程。此外，机械治疗可能进一步创伤牙槽窝壁并延缓愈合。因此，寻找更有效和微创的治疗方法是现代牙科面临的紧迫挑战。
近几十年来，激光技术引起了医生们的极大兴趣。激光疗法因其精确性、微创性、消毒作用、调节细胞代谢和刺激再生的能力，为口腔炎症性疾病治疗提供了新视角。特别是波长为980 nm的二极管激光，基于其在血红蛋白和水中的最佳吸收，确保了良好的止血和消融效果，同时对周围组织影响温和。据信，其在牙科中的应用可提供有效的抗菌、减轻炎症、缓解疼痛并加速上皮化和肉芽组织形成。然而，尽管个别初步研究结果令人鼓舞，支持二极管激光广泛用于干槽症的证据仍不足。
本研究旨在比较980 nm单激光疗法与980 nm和1550 nm双波长疗法对牙槽窝愈合和减少并发症的影响。为实现此目标，我们基于术后牙槽窝充血、肿胀、疼痛综合征和软组织再生率的动态变化进行了临床状况评估。对活检组织进行组织学分析以确定激光治疗是否调节炎症或再生。对牙槽窝内容物进行微生物学研究，以确定980 nm激光的最佳模式、微生物菌群组成，并比较评估激光疗法的抗菌效果。
2. 材料与方法
2.1. 研究设计
所有程序符合国际动物福利标准，并经当地伦理委员会批准（协议号09-24，日期2024年4月3日）。实验在谢切诺夫大学主要动物房及其牙科研究所外科牙科系进行。动物来源为俄罗斯联邦国家预算机构“VGNKI” “Manikhino”。样本量计算假设I类错误概率为5%（p = 0.05），II类错误概率为10%（研究功效90%）。根据上述标准，每个时间点每个实验组的最小观察数为6个组织样本（第7天18个拔牙窝，第12天18个）。计算使用ClinCalc.com样本量计算公式。
实验涉及18只健康成年雄性青紫蓝兔，年龄14-16个月，体重3-3.5公斤。动物饲养温度18–22 °C，湿度50–65%，12小时光照周期，每小时10次空气交换。兔子饲养于铺有木屑的独立笼中，木屑每日更换。饮食为标准配合饲料和过滤水。饲养条件符合欧洲议会第63号指令和俄罗斯卫生部第267号命令。排除标准包括雌性、无预先免疫抑制、体重低于3公斤或超过3.5公斤、不同品种或无检疫许可的兔子。主要排除标准是致死性结局（可能发生在涉及镇静的外科手术后）。每个研究组包括来自六只不同兔子的六个牙槽窝，其中三个源自下颌骨，三个源自上颌骨。由于实验涉及两个评估时间点（第7天和第12天）和三种治疗方式，每个时间点所需动物总数为九只。
研究设计如图1所示。通过拔除18只兔子的2.1和3.1号牙齿（共36个牙槽窝）诱导受损牙槽窝愈合模型。采用两级随机化策略：首先将动物分配至两个终点组（第7天和第12天），其次将个体牙槽窝随机分配至治疗方式。每个时间点分配九只兔子（18个牙槽窝）。每个终点每组包括六个牙槽窝：常规处理、980 nm激光治疗、联合980 + 1550 nm激光治疗。临床监测和宏观评估进行至第12天。微生物样本在第1、5、7天获取，组织学分析在指定终点（第7天和第12天）进行。
主要终点是术后第7天炎症发现严重程度的降低，表示为充血、水肿和疼痛的评分。次要终点包括（1）缺损闭合率和组织形态计量学分析的肉芽组织厚度，以及（2）牙槽窝微生物负荷（CFU/mL）的减少。
2.2. 激光设备特性
使用Alta-Soyuz外科激光设备（医疗器械注册证2021年1月12日第2020/13139号，VPG LaserOne，莫斯科，俄罗斯）作为基础，包括波长为980 nm的二极管激光（通过光纤接触效应输送辐射）和波长为1550 nm的光纤激光（非接触效应组织-点阵激光治疗）。980 nm波长用于激光治疗牙科（治疗阿弗他溃疡、疱疹等口腔黏膜疾病）、牙髓病学、牙周炎治疗、美学牙科手术（牙龈退缩、牙龈成形术）、口腔软组织接触手术（口腔黏膜炎症性疾病、系带切除术、冠周龈瓣切除术）和种植学。1550 nm波长疗法用于牙龈生物型修改手术、囊肿硬化疗法、退缩闭合、口腔黏膜脱色素、疤痕平滑和牙龈角化。
这些设备具有高精度、微创性和加速再生过程的能力，使其在干槽症治疗中具有前景。
激光治疗参数分别针对980 nm和1550 nm激光列出。峰值输出功率、光斑尺寸、占空比、重复频率和光纤尺寸取自技术手册。
波长980 nm：峰值输出功率25 W，光束发散度0.4 ± 0.1 rad，功率密度19.8 kW/cm2，组织上光斑尺寸/光束直径0.4 mm，能量密度198 kJ/cm2，占空比10%，重复频率10 Hz，光纤芯尺寸365 μm。暴露时间：2秒（动物研究），1、2、3秒（微生物学研究）。光斑面积：0.00126 cm2。功率密度：19.8 kW/cm2。脉冲持续时间：10 ms。能量通量密度：198 J/cm2。980 nm激光光纤直接接触创面，并在2秒暴露时间内以椭圆轨迹移动覆盖牙槽窝。
波长1550 nm：输出峰值功率1.5 W，光束发散度0.4 ± 0.1 rad，功率密度530 W/cm2，组织上光斑尺寸/光束直径0.6 mm，能量密度/能量0.053 J/cm2，脉冲模式（SP），极低占空比（0.1%），重复频率10 Hz，“非接触”模式照射距离3 mm，光纤芯尺寸600 μm。暴露时间3秒。光斑面积：0.00283 cm2。功率密度：530 W/cm2。脉冲持续时间：0.1 ms。能量通量密度：0.053 J/cm2。喷嘴光学为点阵（聚焦）。1550 nm激光光纤使用光纤尖端的固定间隔器定位在牙槽窝上方3 mm处，并在3秒内以椭圆轨迹在表面移动。
制造商每两年进行一次校准。我们的激光设备于2024年4月10日，即实验开始前一周进行了最后一次校准，并在整个研究期间保持静止。
2.3. 手术技术
术前兔子禁食24小时。动物肌肉注射（替来他明和唑拉西泮，Vesotil，剂量5 mg/kg体重）和局部（不含肾上腺素的阿替卡因，剂量0.1 mL/kg）麻醉。使用赛拉嗪（Xyla，剂量0.2 mL/kg）提供肌肉松弛。实验动物2.1和3.1号牙齿的拔除涉及使用镰刀形刮匙和手术刀切割牙齿环状韧带，绕过龈袋至骨组织。用拔牙钳拔牙，尽可能低位夹持牙冠以降低骨折风险。
拔牙窝临时填充棉签15分钟以防止血凝块形成并模拟干槽症愈合。这创造了与临床实践中干槽症患者遇到的并发症相似的条件。第3天，根据该疾病的宏观特征，所有动物均诊断为干槽症。
使用计算机生成的随机列表将兔子随机分配至两个计划观察时间点（第7天和第12天）。然后应用第二级随机化将个体下颌牙槽窝分配至三个实验组之一。每个牙槽窝预先标记唯一的字母数字代码（一个字母+一个数字），并进行组分配。这种两步随机化确保时间点和治疗分配均无偏倚。微生物学分析实施完全盲法。形态学实验室研究员（A.F.）接收解剖位置、组分配和治疗方式信息用于描述性分析；然而，他使用实验室内样本编码和通用形态计量学协议。
第1组（机械方法，无激光治疗），拔牙窝在第3天使用外科方法处理：用牙科刮匙刮治肉芽组织（图2a），随后用0.05%氯己定 antiseptic 溶液处理拔牙窝，放置止血海绵保护创面。
第2组（980 nm激光），拔牙窝在第3天使用牙科激光系统（Alta-Soyuz，波长980 nm）处理3秒，以螺旋方式覆盖整个拔牙窝区域（接触相互作用，图2b）。
第3组（激光980 nm + 1550 nm），拔牙窝在第3天使用牙科激光系统（Alta-Soyuz，IRE-Polis，莫斯科，俄罗斯，波长980 nm）处理3秒，以螺旋方式覆盖整个拔牙窝区域（图2b），并使用牙科激光系统（Alta-Soyuz，波长1550 nm）处理口腔黏膜，沿拔牙窝周边处理2秒（非接触相互作用）。
动物在术后期间接受充分的镇痛治疗（0.03%酮咯酸，Biosynthez，奔萨，莫斯科，俄罗斯），0.1 mL肌肉注射，拔牙后每天两次，持续三天。
缺损状况在第1、3、5、7天进行宏观评估。充血按4分制评估（0—正常颜色，1—轻度充血，2—中度充血，3—明显充血）。水肿按4分制测量（0—无，1—轻微，2—中度，3—严重）。疼痛使用兔鬼脸量表（Rabbit Grimace Scale, RbtGS）评估。缺损大小测量为第7天和第12天实验时宽度和长度两个垂直直径测量的平均值。
为排除牙齿位置（上颌或下颌）对炎症宏观特征的影响，进行了比较分析。比较同一兔子所有观察日上、下颌牙槽窝的充血、肿胀和疼痛，未发现一致显著差异。大多数情况下，同一兔子配对牙槽窝的值要么相同，要么仅略有差异（通常不超过相应量表的1分）。例如，第1天，对照组（无激光）动物上颌牙槽窝充血评分平均比下颌高0.17分（某些兔子2分对1分），而在其他兔子中，下颌牙槽窝有时评分略高。类似地，到第3天，同一组中牙槽窝充血评分趋于相等。在激光治疗组（980 nm和联合980 + 1550 nm），未观察到显著不平衡：大多数时间点，上、下颌牙槽窝之间的差异缺失或约为0.5分，且无统计学意义。
水肿观察到类似模式。在最早阶段观察到牙槽窝之间的微小差异：例如，对照组第1-3天，某些兔子下颌牙槽窝肿胀比上颌略多（差异达1分）。然而，此趋势未在其他动物中维持；观察到上颌肿胀更大，或双牙槽窝肿胀相等。到第5天，所有组所有兔子上、下颌牙槽窝肿胀几乎相同；差异不显著。其余天数（第7天和第12天），肿胀要么缺失，要么最小且每只兔子双牙槽窝相等，无论治疗方法如何。
关于疼痛，最初评估为每只兔子的单一总分（因此，在原表中，此分数为上、下颌牙槽窝重复）。因此，配对牙槽窝的疼痛评分在所有天数对每只兔子一致，且对一只动物，未观察到上、下颌牙槽窝之间的差异。这证实疼痛评分与兔子的整体状况相关，而非特定牙槽窝。
研究期间未发生排除、数据缺失或不良事件，所有动物完成计划程序和随访评估。
2.4. 组织学分析
口腔组织固定在10%中性缓冲福尔马林（Biovitrum，莫斯科，俄罗斯）中。样本在电解液（Biovitrum，莫斯科，俄罗斯）中脱钙两个月，以横断面方向切片，垂直于下颌骨表面，在Epredia STP120旋转组织处理器（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）中用异丙醇脱水，并使用HistoStar包埋工作站（Thermo Fisher Scientific，美国）包埋成石蜡块。脱钙或切片过程中未发生显著组织损失；所有标本保持完整用于分析。使用Leica RM 2125RTS切片机（Leica Microsystems，韦茨拉尔，德国）获得4 μm厚切片，并用苏木精和伊红（Biovitrum，俄罗斯）及天狼星红（Abcam，剑桥，英国）染色。使用NanoZoomer S20MD扫描仪（Hamamatsu，埼玉，日本）在×400放大模式下数字化切片用于形态学分析。肉芽组织层（介于碎屑和牙槽骨之间）的厚度评估为相距200 μm的5次测量的平均值。所有测量由对每个样本实验组分配不知情的病理学家进行。
2.5. 微生物学分析
样本从未经冲洗的牙槽窝采集。体外微生物学研究使用9个试管（1 mL），每个包含微生物悬浮液（麦氏浊度1.5， Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Candida albicans），以确定980 nm激光的最佳模式（暴露时间—1、2、3秒）。悬浮液暴露于激光后，处理试管进行定量微生物学分析。
体内研究，样本在第1、3、5、7天用拭子和无菌容器（ABS塑料，青岛，中国）从牙槽窝采集，并处理用于后续培养（Interscience easySpiral Pro Milk，法国）在琼脂培养基（含脑心浸液的琼脂，Condalab，马德里，西班牙）上，分析拔牙窝内容物（MALDI Biotyper?sirius质谱仪，Bruker，不来梅，德国）和定量微生物学分析（Interscience Scan 4000自动菌落计数器，法国）。
使用接触温度计测量微生物悬浮液温度，浸入式探头直接插入溶液。最高温度不高于42 °C被视为可接受。证明在溶液温度≤ 42 °C时能减少微生物数量的照射方案被认为适合进一步使用，同时保持适当的热暴露。
营养培养基的制备和分装使用MEDIAWEL 10自动培养基蒸煮器和DISTRIWEL 440分装模块（法国）进行。从送达材料制备生理盐水中的两次连续100倍稀释。所有稀释度，包括原始样本，均接种在具有适当营养琼脂的Petri培养皿上。平行在三种培养基上培养：含1% arapa的脑心浸液琼脂（HighMedia Laboratories Pvt. Ltd.，印度）；添加（5%）马去纤维蛋白血（JSC ECOlab，莫斯科，俄罗斯）的脑心浸液琼脂；用于真菌分离的沙氏培养基（国家水文研究所，圣彼得堡，俄罗斯）。使用easySPIRAL Pro自动培养站，Intersciens（法国），以螺旋模式50 μL体积将细菌悬浮液培养到Mueller Hinton琼脂平板（HiMedia，印度）上。平板在正常大气中37 °C培养24小时（Thermo B-20恒温培养箱，瑞典），血琼脂在含5.5% CO2大气中37 °C培养24小时（MCO-15AC培养箱，Sanyo Electric Co., Ltd.，大阪，日本），沙氏培养基在正常大气中32 °C培养48小时。使用Scan4000自动菌落计数器，Intersciens（法国）记录结果。计数每个稀释度的菌落，并将获得的结果乘以稀释因子。获得纯微生物培养物。使用MALDI-TOF质谱法在MALDI Biotyper Sirius RUO系统（Bruker，不来梅，德国）上鉴定微生物培养物。如果数据库匹配系数（Score）大于或等于2.0，则认为鉴定结果可靠。
2.6. 统计分析
实验数据的统计分析使用标准程序包GraphPad Prism 10.00 for Windows（GraphPad Software, Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行。定量数据的正态分布通过Shapiro–Wilk正态性检验检查。缺损大小、肉芽组织厚度和微生物学结果的组间差异通过单因素方差分析（one-way ANOVA）随后进行Tukey多重比较检验分析；结果以平均值±标准差柱状图呈现。评分差异使用Kruskal–Wallis检验与Dunn多重比较检验评估；结果以中位数和四分位距CI柱状图呈现。Friedman检验应用于重复测量。p值小于或等于0.05被认为具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 宏观评估
使用980 nm单疗法和980 nm + 1550 nm组合均显示出比无激光治疗更有效的缓解干槽症症状效果。实验第1天，研究组间充血、水肿或疼痛无差异。第3天充血和水肿标志物升高，然而，双波长治疗组充血有低于对照组或单激光治疗组的趋势（p值分别为0.07和0.15）。充血（p = 0.049）和水肿（p = 0.005）的差异持续至实验第7天。有趣的是，单激光治疗后水肿相比无激光对照组有非显著升高；然而，平均评分差异仅为0.5（图3）。
严重疼痛综合征在所有研究组持续超过3天。第5天，双波长组疼痛评分有比对照组和单激光组降低0.75分的趋势（p = 0.16）。自第7天起，双波长组任何兔子均未记录到疼痛，即使1级水平也未记录。然而，其他组兔子在第7天和第12天记录到轻度1级疼痛。
计算了所有观察中疼痛、肿胀和充血程度之间的相关性。发现所有三个临床指标之间存在可靠的正相关关系：肿胀评分与充血评分显著相关（Spearman相关系数 rs≈ 0.73, p < 10?27），也与疼痛水平相关（rs≈ 0.57, p < 10?14）。疼痛与充血之间的相关性也高度显著（rs≈ 0.63, p < 4 × 10?18）。这些结果表明更明显的炎症（组织发红和肿胀）通常伴随更严重的疼痛，这很自然。最显著的关系见于牙槽窝充血和肿胀之间。疼痛与客观炎症体征之间的关系较不显著（中度相关），这可通过疼痛敏感性的个体差异以及到第7至12天，虽然最小炎症体征仍存在，但无疼痛来解释。
3.2. 组织学分析
兔口腔组织包括牙齿和牙龈，下方为牙槽骨。黏膜覆盖着分层角化上皮，其特征是频繁、短的乳头。上皮下方是固有层，由多向胶原束组成，而黏膜下层包含致密结缔组织，带有血管、脂肪细胞、肌纤维和唾液腺导管。
第7天，对照组
