《Phycology》：Application of Spirulina platensis and Chlorella vulgaris for Improved Growth and Bioactive Compound Accumulation in Achillea fragrantissima In Vitro
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本文综述了螺旋藻（S. platensis）与小球藻（C. vulgaris）作为天然生物刺激剂，在体外条件下显著促进香料蓍草（A. fragrantissima）生长、提升光合色素含量并优化其精油成分（如植醇、油酸等）的研究，为可持续农业和植物源药物开发提供了新策略。
引言
香料蓍草（Achillea fragrantissima）是一种属于菊科（Asteraceae）的芳香多年生草本植物，原产于中东和北非的干旱及半干旱地区。它在民间医学中被广泛应用，用于缓解胃肠道疾病、炎症、呼吸道感染和皮肤创伤等。该植物富含精油、黄酮类、倍半萜内酯、酚酸和萜类化合物等植物化学活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌和解痉等特性。近年来，科学研究的关注点转向如何利用环境友好型输入策略来提高药用植物的产量和品质，其中微藻类生物刺激剂展现出巨大潜力。
螺旋藻（Spirulina platensis）和小球藻（Chlorella vulgaris）作为两种重要的微藻，因其生态韧性、快速生物量生产和丰富的生化成分而被视为可持续食品生产的有前途解决方案。它们不仅是食品、药品和化妆品的原料，还能作为天然生物肥料，增强植物生长、改善胁迫耐受性，并提供化学肥料的环保替代品。在植物组织培养中应用藻类生物刺激剂，能够在无菌、受控的条件下生产高质量植物材料，确保观察到的生物或化学响应完全归因于所施加的处理，这对于提高次生代谢产物的产量和一致性至关重要。
材料与方法
螺旋藻和小球藻粉末购自Earth Circle Organics（美国）。水提物的制备方法为：将5克干燥微藻粉末与50毫升无菌蒸馏水混合，均质1分钟，然后在4°C下以8000× g离心10分钟，收集上清液作为藻类水提物。对两种微藻粉末的宏观和微观营养成分进行了分析，包括蛋白质、矿物质（磷、锰、铁、钙、锌）、维生素和氨基酸的定量。采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析了甲醇提取物中的植物化学成分。
香料蓍草种子采集自沙特阿拉伯利雅得地区的Wadi Harqan，并经King Saud大学植物学与微生物学系的Mona Alwheeby教授鉴定。种子经过表面灭菌（70%乙醇30秒，5%次氯酸钠5分钟）后，接种于含有半强度MS（Murashige and Skoog）基础盐和维生素、30 g·L?1蔗糖和7 g·L?1琼脂的培养基中，在23 ± 2 °C、16小时光周期、4000 lux光照强度的培养室中萌发。
从体外萌发幼苗中切取一个月生的茎尖外植体（0.5–1.0厘米），接种于含有MS基础培养基、3%蔗糖、6 g·L?1琼脂和0.2 mg·L?1苄氨基嘌呤（BAP）的200毫升培养容器中。将过滤灭菌的螺旋藻和小球藻水提物单独或组合加入培养基中。实验设计为完全随机区组设计，包括九个处理：对照、0.5和1.0 g·L?1螺旋藻、0.25和0.5 g·L?1小球藻，以及四种组合处理（0.5 + 0.25, 0.5 + 0.5, 1.0 + 0.25, 和1.0 + 0.5 g·L?1螺旋藻+小球藻）。每个处理10个培养容器，每个容器含2个茎尖。培养条件为24 ± 2 °C，16小时光周期，光照强度约4000 lux。培养一个月后，记录生长参数，包括外植体鲜重、最大芽长、芽数、每外植体叶数和愈伤组织形成百分比。光合色素含量通过80%丙酮提取，紫外-可见分光光度计测定。采用GC-MS分析香料蓍草甲醇提取物中的植物化学成分。
结果
螺旋藻和小球藻粉末的化学成分分析显示存在差异。螺旋藻含有高比例的蛋白质（58%）以及铁、锰、磷等必需矿物质，同时含有B族维生素和维生素E。其甲醇提取物的主要成分为5-氧代四氢呋喃-2-羧酸（24.10%）、油酸甲酯（23.67%）、棕榈酸甲酯（12.31%）和双（叔丁基）二氮烯（11.19%）。相比之下，小球藻的蛋白质（60%）和碳水化合物（40%）含量略高，矿物质包括钙、铁、磷和锌，以及维生素A、B12和C。其甲醇提取物以油酸甲酯（19.75%）、棕榈酸甲酯（12.08%）、植醇（9.82%）、棕榈酸（8.82%）和醛类为主要成分。
在香料蓍草的体外形态发生方面，微藻提取物的应用产生了显著影响。0.5 g·L?1螺旋藻处理使芽长增至2.67厘米，鲜重达1.214克，每外植体芽数和叶数分别达到17.33和61.2，愈伤组织形成率为25%。1.0 g·L?1螺旋藻进一步提高了芽数（18.67）和叶数（67.2）。0.5 g·L?1小球藻处理表现出最强的形态发生效应，获得最高芽数（34.33）和叶数（134.93）。组合处理中，0.5 g·L?1螺旋藻 + 0.25 g·L?1小球藻产生了最长的芽（2.83厘米）和增加的叶数（71.5），而1.0 g·L?1螺旋藻 + 0.5 g·L?1小球藻导致芽长和鲜重减少，但愈伤组织形成率显著增加至50%。这表明适中的微藻浓度促进器官发生，而高剂量则倾向于诱导愈伤组织形成。
光合色素分析表明，微藻处理对香料蓍草的光合性能有调节作用。螺旋藻和小球藻组合处理（1.0 + 0.25 g·L?1）显著提高了叶绿素a含量和总叶绿素含量。0.5 g·L?1小球藻处理使叶绿素b含量达到最高。类胡萝卜素含量在0.5 g·L?1螺旋藻处理下达到峰值（77.79 mg/100 g鲜重）。这些结果提示适当的微藻组合能有效增强香料蓍草的光合色素积累。
GC-MS分析揭示了微藻处理对香料蓍草精油成分的显著影响。与野外生长植株和对照相比，微藻提取物处理，尤其是组合处理，极大地改善了几种有价值生物活性物质的积累。胸腺嘧啶在0.5 g·L?1螺旋藻 + 0.25 g·L?1小球藻组合处理下积累量最高。十二酸、油酸、2H-吡喃-3,4-二氢、植醇、1-十九碳烯、9-十八碳烯酸甲酯和脱氧芥子油苷等化合物在螺旋藻和小球藻的组合处理下达到最大浓度。值得注意的是，某些化合物如氧化环十六烷仅存在于野生植株和0.5 g·L?1小球藻处理中，而石竹烯氧化物则仅存在于野生植株、对照和0.25 g·L?1小球藻处理中。α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯在1.0 g·L?1螺旋藻及其与0.5 g·L?1小球藻的组合处理中含量最高。这些结果表明，微藻提取物，特别是组合应用，能够定向调节香料蓍草的次生代谢途径，促进特定生物活性成分的合成。
讨论
本研究证实了螺旋藻和小球藻水提物能够显著增强香料蓍草的体外生长、光合性能和次生代谢物合成。其效果的大小和方向强烈依赖于提取物浓度以及是否联合应用。两种微藻的植物化学和营养成分差异在很大程度上解释了它们不同的生理影响。螺旋藻富含蛋白质、矿物质和维生素，以及含氮和杂环化合物，这些可能作为植物生长和防御化合物的代谢前体。小球藻则含有较高的碳水化合物、蛋白质、矿物质以及多样的脂肪酸衍生物、长链醇和植醇，这些与增强膜稳定性和叶绿素生物合成有关。
在形态发生方面，适中的藻类提取物浓度（如0.5 g·L?1）最有效地刺激了芽的启动、增殖和叶片形成。而较高剂量，尤其是在组合处理中，则倾向于诱导愈伤组织形成并减少芽的伸长。这种剂量依赖性模式表明，在最佳水平下，藻类提取物提供有益的营养物质、植物激素和信号化合物，促进器官发生。然而，过量浓度可能引发渗透或氧化胁迫，或破坏内源激素（如生长素和细胞分裂素）的平衡，导致非组织化的愈伤组织发育。
光合色素的增强进一步支持了微藻处理的促生长作用。螺旋藻中含有的藻蓝蛋白和维生素E等关键生物活性成分，可能通过其抗氧化活性和光捕获能力，有助于稳定光合膜结构、减轻氧化应激，从而支持光合效率。小球藻则因其高β-胡萝卜素和抗氧化剂含量，在提升类胡萝卜素积累方面更为有效。
对香料蓍草精油成分的影响尤为显著。螺旋藻处理对脂肪酸和其他生物活性代谢物产生了更强的影响，这可能与其提供的脂质前体以及作为生物合成途径辅因子的维生素和微量元素有关。当螺旋藻和小球藻联合应用时，观察到协同效应，导致胸腺嘧啶、油酸、植醇等几种关键化合物的显著增加。这表明两种藻类的组合提供了更广泛的生物活性分子，共同刺激次生代谢途径，效果优于单独使用任一种藻类。
结论
研究结果表明，螺旋藻和小球藻水提物单独或组合应用，均能显著增强香料蓍草的体外生长和形态发生。0.5 g·L?1螺旋藻改善了芽长、鲜重、叶数和愈伤组织形成，而0.5 g·L?1小球藻促进了最高的芽增殖和叶片发育。0.5 g·L?1螺旋藻与0.25 g·L?1小球藻的组合产生了最长的芽、增加的叶数和提高的愈伤组织形成率。这些处理还对光合色素产生了积极影响，增强了叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素的含量。GC-MS分析表明，微藻处理调节了香料蓍草的精油成分，关键生物活性化合物在组合处理下积累最为显著。这些发现凸显了适当应用微藻提取物在有效增强香料蓍草生长和次生代谢物生产方面的潜力，证实了它们作为该物种组织培养天然生物刺激剂的应用前景。
