小球藻IPPAS C-1半连续培养模式的优化：实现平板光生物反应器中高质量生物质的稳定生产

《Phycology》：A Reliable Semi-Continuous Cultivation Mode for Stable High-Quality Biomass Production of Chlorella sorokiniana IPPAS C-1

本研究为小球藻（Chlorella sorokiniana）IPPAS C-1菌株在平板光生物反应器（FP PBR）中的工业化培养提供了一种可靠方案。通过对比批次与不同稀释比例（50%、75%、87.5%）的半连续培养模式，发现75%稀释比例在长达15天、7个收获周期的实验中表现最优，不仅能获得最高的生物质产率（1.36 g DW L?1day?1），而且能维持蛋白质、脂质、碳水化合物及色素等生化组成的稳定，为开发可扩展的工业化微藻培养协议奠定了坚实基础。

　　

1. 引言

光合微生物，如微藻和蓝细菌，在生物技术领域具有巨大的商业化潜力。然而，大规模微藻生产面临着降低成本的挑战。优化培养模式是解决此问题的途径之一。半连续培养结合了批次培养的简单性和连续培养的周期性收获优点，通过控制稀释比例和收获周期这两个关键操作参数，能够实现长期、稳定的培养，并控制微藻细胞的生长速率和生化组成。本研究旨在探讨不同稀释比例对小球藻（Chlorella sorokiniana）IPPAS C-1菌株在平板光生物反应器（FP PBR）中半连续培养下的生长、生化组成及光合活性的影响，以期为该菌株的工业化生物工艺开发提供依据。

2. 材料与方法

2.1. 微藻菌株与培养条件

实验采用源自俄罗斯科学院植物生理研究所微藻和蓝细菌保藏中心（IPPAS）的小球藻IPPAS C-1无菌菌株。预培养在特定条件下进行，为光生物反应器接种做准备。

2.2. 光生物反应器系统

研究使用工作体积为5升的平板光生物反应器（FP-5 PBR），其内部尺寸为361 × 460 × 40 mm（长×高×宽）。每个PBR配备LED照明模块（平均辐照度I_ave= 800 ± 70 μmol photons m^?2s^?1）、温度控制系统（35.5 ± 0.5 °C）和气体供应系统。气体-空气混合物（GAM）以0.2 vvm的速率供应，其中CO₂浓度为1.5%。所有实验均设三个生物学重复。

2.3. 培养模式

实验首先进行批次培养以建立生长曲线。随后，在初始3天的批次培养后，启动半连续培养，测试三种不同的稀释比例（50%， 75%， 87.5%），收获和稀释操作每两天进行一次。

2.4. 生长特性分析

通过测量培养液在750 nm的光密度（OD₇₅₀）和干重（DW）来监测生物量浓度。基于这些数据计算生产力（P, g DW L^?1d^?1）和比生长速率（μ, d^?1）。

2.5. 二氧化碳利用效率（CUE）

计算了总二氧化碳利用效率（CUE）和每日二氧化碳利用效率（CUE_i），以评估培养系统固定CO₂的效率。

2.6. 生化组成分析

在培养的不同时间点（第3、9、15天，分别对应第1、4、7次收获）取样，分析生物质的生化组成，包括：

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  蛋白质： 采用机械破碎结合BCA法测定。
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  淀粉： 通过碱提、醇沉、酸水解后使用苯酚-硫酸法测定葡萄糖含量。
• •
  总脂质与脂肪酸谱： 通过皂化、萃取、甲酯化后，使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析脂肪酸甲酯（FAME）。
• •
  色素： 甲醇提取后，根据特定波长下的吸光度计算叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和总类胡萝卜素（Car）的含量。

2.7. 光合活性测定

使用Clark型氧电极测定暗适应后藻细胞在强光下的氧气释放速率，以评估其光合活性。

2.8. 统计分析

所有结果均以三个生物学重复的平均值±标准差表示。使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD事后检验进行统计学显著性分析。

3. 结果

3.1. 批次培养

在批次培养模式下，小球藻IPPAS C-1在FP-5 PBR中培养10天。最高生物量浓度（7.21 ± 0.40 g DW L^?1）出现在第8天，最高比生长速率（2.25 ± 0.05 d^?1）出现在第1天。二氧化碳利用效率（CUE）在第3天达到峰值（39.8 ± 4.3%），之后随着培养进入稳定期而下降。基于此，确定后续半连续培养实验均以3天的批次预培养开始。

3.2. 半连续培养

比较不同稀释比例（50%， 75%， 87.5%）的半连续培养模式发现：

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  50%和75%稀释比例下，培养物能维持相对稳定的比生长速率（μ）。
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  87.5%稀释比例下，比生长速率在第5次稀释周期（第11天）后急剧下降。
• •
  总体而言，较高的稀释比例与较高的比生长速率相关。
• •
  75%稀释比例获得了最高的总生物量产量，比50%模式高18.4%，比批次模式高58.5%。

因此，75%的稀释比例被确定为最优条件。

3.3. 生化组成与光合活性（基于75%稀释比例）

3.3.1. 色素含量与光合活性

在长达15天（7个收获周期）的半连续培养期间，藻细胞的色素组成保持相对稳定。叶绿素a含量从首次收获（第3天）的26.0 ± 0.75 mg g DW^?1略有下降，并在后续收获中稳定在约22.5 mg g DW^?1。叶绿素b和类胡萝卜素含量无显著变化。光合活性（氧气释放速率）从第1次收获到第4次收获显著增加，随后有所下降，但在第7次收获时仍与第1次收获无显著差异。

3.3.2. 蛋白质、总脂质和碳水化合物组成

主要生化成分（蛋白质、淀粉、总脂质）的含量在整个培养期间保持稳定，无统计学显著变化。平均组成如下：

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  蛋白质：23.84 ± 0.66 % DW
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  淀粉：21.29 ± 2.59 % DW
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  总脂质：5.73 ± 0.75 % DW
  脂肪酸（FA）谱和未饱和指数（UI）也保持稳定，主要脂肪酸包括亚油酸（18:2^Δ9,12）、棕榈酸（16:0）、十六碳二烯酸（16:2^Δ7,10）、α-亚麻酸（18:3^Δ9,12,15）和十六碳三烯酸（16:3^Δ7,10,13）。

4. 讨论

4.1. 批次培养

本研究在优化的高强度培养条件下（高光强、高CO₂、富营养培养基），实现了小球藻IPPAS C-1的高密度生长。与使用较短光程反应器的研究相比，本研究的FP-5 PBR配置虽然在体积产率上较低，但总生物量产量更高，更侧重于工业化生产的总产出。

4.2. 半连续培养

半连续培养的效率取决于稀释率（由稀释比例和收获频率共同决定）。高稀释比例有利于光穿透和营养供应，从而维持高比生长速率，但需要权衡每周期的生产力和总产量。本研究发现75%的稀释比例结合2天的收获周期是实现这一平衡的最佳点，确保了长期培养的稳定性和高产量。优化的水力停留时间（HRT）对于维持培养物处于最大生长阶段至关重要。

4.3. 生物质组成和光合活性的稳定性

优化的半连续培养模式（75%稀释比例）不仅提高了生产力，还促进了光合活性的增强，并确保了生物质生化组成的稳定。这种稳定性对于商业化生产高质量微藻原料或提取特定有价值化合物至关重要。本研究中小球藻IPPAS C-1表现出代谢灵活性，在所述条件下能稳定积累相当量的蛋白质和淀粉。虽然通过改变培养条件（如营养限制）可以诱导特定化合物（如淀粉或脂质）的过量积累，但当前策略提供的操作稳定性对于工业化应用更具吸引力。

4.4. 小球藻菌株半连续培养的前景

半连续培养模式的适应性强，结合小球藻菌株卓越的环境适应能力，使其适用于广泛的生物技术应用，包括废水处理、生物燃料和高价值化合物生产等。本研究证实了小球藻IPPAS C-1在平板光生物反应器中采用半连续模式生产稳定、高质量生物质的可行性，为其在食品、饲料、医药和化妆品等领域的应用提供了技术支撑。

5. 结论

本研究系统评估了小球藻（Chlorella sorokiniana）IPPAS C-1在平板光生物反应器中的半连续培养模式。结果表明，每两天收获75%培养体积并补充新鲜培养基的策略是最优的，能够在15天的培养期内（7个收获周期）实现高的、稳定的生物质产率（1.36 ± 0.04 g DW L^?1day^?1），同时保持生物质生化组成的稳定。该研究为开发基于小球藻IPPAS C-1和平板光生物反应器系统的可扩展、高效工业化培养协议奠定了坚实基础。