《Diversity》：Foraging Habitat Selection of Shrubland Bird Community During the Dry Season in Tropical Dry Forests
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本研究首次系统评估了立陶宛河流中篦齿眼子菜（Stuckenia pectinata）的遗传多样性与种群结构，综合运用简单序列重复（SSR）和间简单序列重复（ISSR）两种分子标记。研究发现种群内存在高遗传多样性，主要遗传变异存在于种群内部（FST= 0.212, ΦPT= 0.352-0.432），并揭示出两个显著的基因型库，表明其种群结构主要由进化及种群统计学机制（如遗传漂变和克隆繁殖）塑造，而非当地水文化学环境。该研究为淡水生态系统的保护与监测提供了重要的遗传学依据。
1. 引言
小型和中型河流构成了欧洲水道的重要组成部分，其健康状况深刻影响着河流内部及周边的生态系统。诸如《拉姆萨尔公约》、Natura 2000网络和欧盟水框架指令（2000/60/EC）等国际协议旨在保护最具价值的水生生态系统。对这些资源进行可持续开发，需要具备全面的相关知识。河流生态系统的状态与其栖息的淡水植物（大型植物）物种的状态密切相关。大型植物是溪流和河流生态系统的基本组成部分，它们承受着多种人为压力，为多种动物提供食物和庇护所，并显著影响水质。它们能稳定沉积物、参与营养物质的循环和储存、富集水中的氧气、吸收过量的氮和磷，并释放抑制水华的物质。然而，在特定生态情境下，大型植物（尤其是入侵物种）可能过度生长，降低水流速度并导致水质退化。
在沉水关键大型植物中，篦齿眼子菜（Stuckenia pectinata (L.) B?rner）是一种重要且生态及遗传多样性丰富的物种，分布于除北极和南极地区外的所有地理区域。S. pectinata 具有多种繁殖策略，既能通过种子进行有性繁殖，也能通过块茎、根状茎和茎（枝条）片段进行无性繁殖。篦齿眼子菜表现出高度的形态和生态可塑性，使其能够在各种生境中繁茂生长，包括不同的淡水水源和半咸水海岸海域，以及不同营养状况的水体。该物种被广泛用作生态学研究的模式生物。
早期的遗传多样性研究使用同工酶标记，结果表明种群分化程度高、遗传多态性低，且无性繁殖对种群结构有显著影响。随着分子标记技术的发展，使得能够更全面地分析种群遗传多样性。例如，利用DNA标记的研究报告了相对较高的克隆多样性，并强调了有性繁殖对 S. pectinata 遗传变异的重要性。种群遗传参数受到各种生物和非生物因素的影响。有研究表明，水深、淤泥含量和天鹅对块茎的捕食等因素会降低克隆多样性。
以往的研究调查了来自各种水源（如海岸、湖泊、池塘、河段和湿地）的 S. pectinata 种群。本研究重点关注那些干扰程度和水体物理化学特征各异的河流种群。立陶宛的天然河网在20世纪因经济活动发生了巨大变化，河流被加深、疏浚、取直、调控和筑坝。这些人为的河流改造可能导致遗传破碎化和遗传漂变。此外，河床中设置的障碍物和流态的变化会导致大型植物出现频率的变化，阻碍水媒传播，并可能影响幼苗存活。河流调控也影响植物种群的遗传结构和扩散模式，并增加外来物种的入侵。
鉴于立陶宛河流广泛的人为改变以及该地区 S. pectinata 遗传研究的缺乏，本研究旨在评估遗传变异在河流种群中的分布情况。我们假设 S. pectinata 的遗传多样性和结构主要由进化机制和种群统计学机制（如遗传漂变、克隆性和有限的扩散）塑造，而非当地水文化学或水文形态学因素。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料
植物材料样本于2016年至2017年间主要从立陶宛南部和东部的河流中采集。这些河流在大小、流域面积、流量和河床改造程度方面各不相同。共设置了30个采样点，每条河流有2至4个点。样本采集时彼此间隔至少5米。植物材料被置于带冰的冷却器中运输至实验室。抵达后，依据既定指南对标本进行重新分类鉴定。
2.2. DNA分析
使用改良的CTAB法从381株 S. pectinata 植物的新鲜叶片中提取DNA。
对于SSR分析，使用了9个微卫星位点（Potpect24, Potpect26, Potpect28, Potpect32, Potpect34, Potpect37, Potpect39, Potpect40, Potpect42），这些位点先前已被鉴定并在立陶宛种群中表现出变异。对来自9个种群的151个个体进行了分析。PCR反应在Mastercycler ep梯度热循环仪上进行。使用Applied Biosystems Genetic Analyzer 3500进行基因分型，并通过GeneMapper软件分析数据。为确保DNA扩增的重现性，所有位点均有20个样本进行了重复实验。
对于ISSR分析，测试了20个寡核苷酸引物，最终选定了8个能产生清晰、可重复DNA条带的ISSR引物。初步阶段分析了与SSR检测相同的151株植物。基于所得结果，研究扩展到10个种群的351个个体，使用选定的引物进行分析。ISSR-PCR在Mastercycler ep梯度热循环仪上进行。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，溴化乙锭染色后观察记录。
2.3. 数据分析
考虑到所研究河流规模较小且采样点位置集中，将同一河流的所有样本视为属于同一种群。尽管 S. pectinata 是六倍体物种，但先前研究表明其微卫星位点表现为二倍体特性，因此等位基因数据矩阵基于此假设构建。使用MICROCHECKER软件评估潜在的评分错误，未发现存在无效等位基因、大等位基因丢失或stutter相关错误的一致证据，故所有位点均保留用于后续分析。
ISSR-PCR产生的可重复DNA条带被评分并编译成二进制数据矩阵用于分析。使用GenAlEx软件中的多位点匹配功能鉴定克隆。使用GENEPOP软件评估每个位点和种群的哈迪-温伯格平衡。使用FSTAT软件计算近交系数和遗传分化指数。使用POPGENE和GenAlEx软件计算等位基因数、有效等位基因数、香农指数、观察杂合度和期望杂合度等遗传多样性参数。使用AFLPDIV软件分析ISSR条带丰富度和多态性条带比例。使用GenAlEx软件进行分子方差分析（AMOVA）和主坐标分析（PCoA）。使用STRUCTURE软件基于贝叶斯聚类方法评估遗传结构。使用Mantel检验评估地理距离对种群遗传结构的影响。使用IBM SPSS Statistics软件分析河流改造状态分组间的差异，并计算遗传多样性参数与水文化学、物理特征参数之间的Pearson相关性。
3. 结果
3.1. S. pectinata种群的SSR分析
对9个种群的植物进行SSR分析，9个SSR位点共获得78个等位基因。每个位点的平均等位基因数为8.67。共鉴定出52个独特基因型和25个多克隆基因型。种群平均等位基因数为3.086 ± 0.142。排除无性系分株后，分析种群数减至8个，平均每个种群研究基因型数为9.5，平均等位基因数为3.264 ± 0.248。观察杂合度在种群间变化相似。在大多数位点和种群中观察到偏离哈迪-温伯格平衡的情况，主要是由于杂合子过量。所有种群的Fis值均为负值。
3.2. S. pectinata种群的ISSR分析
初步阶段使用8个ISSR引物分析与SSR多态性研究相同的9个种群和基因型，共鉴定出146个多态性条带，平均每个引物18.25条带。条带大小在380至2000 bp之间。所有样本平均多态性为73.27%。种群平均多态性为32.65 ± 5.39%。在ULA和SES种群中观察到特有条带。基因型间ISSR和SSR标记遗传距离的相关系数为r = 0.592。基于两种标记获得的ΦPT矩阵间也存在显著相关性（r = 0.619）。鉴于两种标记遗传距离的相关性，后续扩大了仅使用ISSR标记的研究规模。
对10个不同种群的381株植物使用8个ISSR引物进行分析，鉴定出159个多态性ISSR条带。从中鉴定出287个独特基因型。基于这些基因型计算种群遗传多样性参数。种群平均多态性为41.76% ± 5.49%。香农指数和期望杂合度等参数均在NER种群最高，在STR种群最低。
3.3. 种群遗传结构
基于SSR标记对8个 S. pectinata 种群遗传结构分析表明，平均遗传分化FST = 0.212。AMOVA揭示大部分遗传变异存在于种群内部（ΦPT = 0.352）。后续使用ISSR标记对10个种群加倍数量的基因型进行分析，再次发现更大比例的遗传变异存在于种群内部（ΦPT = 0.432）。分层AMOVA显示，区域（流域）间的遗传分化率为20%。
基于ISSR标记的主坐标分析（PCoA）显示，基因型大致分为两或三个主要簇。大部分种群基因型形成一个共同的基因库并相互混合，但部分SES和NER种群基因型与其他群体差异显著。第一坐标轴解释了总变异的24.32%，第二轴为19.59%，第三轴为16.23%。
使用STRUCTURE软件评估种群遗传结构，最高DeltaK值出现在K=2，表明遗传结构由两个不同的基因型库组成。红色簇包含NER种群基因型和部分SES种群基因型。SES种群是异质的，包含来自两个簇的基因型。其余八个种群被归入绿色簇，除ULA外，所有种群均表现出不同程度的红色基因型库混杂。
Mantel检验未发现地理距离与遗传距离（分别基于SSR和ISSR标记评估）之间存在显著相关性。
3.4. 遗传多样性与生境参数比较
为更好地理解水体化学参数与种群遗传参数间的潜在关系，计算了每个植物采集点的遗传参数。分析了水体理化特征数据。然而，未发现 S. pectinata 遗传参数与采样点水体理化特征之间存在统计学显著的相关性。比较自然河段与改造河段间的基因型丰富度，未发现两类生境间存在显著统计学差异。尽管自然河段的基因型丰富度有高于改造河段的趋势，但Mann-Whitney U检验表明该差异不显著。评估种群遗传多样性参数与流域面积、河流长度、流量和河流改造等因素的关系，未检测到显著相关性。
4. 讨论
本研究显示，两种分子标记对于分析 S. pectinata 的遗传多样性均具有信息量。SSR标记作为共显性标记，ISSR标记作为显性标记，其数量是前者的四倍以上，符合降低标记间比较偏差的建议。Mantel检验揭示了两种标记系统在种群遗传多样性估计上具有强且显著的一致性。使用两种或更多分子标记能更详细地了解遗传多样性在种群间的分配以及塑造其遗传结构的进化因素，有助于避免因特定标记的分子性质和在物种基因组中的分布而产生的偏差。标记间的显著相关性表明兼容性，并且观察到的DNA多态性在很大程度上独立于标记特异性因素，而受遗传漂变和迁移等关键进化力量的影响。
4.1. 遗传多样性
本研究中，通过SSR标记估计的种群内遗传变异通常大于ISSR标记的估计值，且离散程度更大。SSR位点的多态性百分比远高于ISSR位点，这支持了共显性标记在捕捉种群内变异方面具有更优分辨率的早期观察。
如前所述，S. pectinata 的遗传多样性相对较高，不能仅归因于营养繁殖。克隆在种群内很常见，这是依赖无性繁殖物种的典型特征。通常，克隆具有地点特异性。然而，发现一个克隆分布在三个不同地点。一些河流的高基因型丰富度表明，有性繁殖偶尔会产生新的基因型，随后通过克隆生长扩散。具有最高基因型丰富度和最多独特基因型的河流也表现出相对较高的等位基因丰富度和期望杂合度，表明有性繁殖的贡献较大。
使用SSR标记，我们检测到78个SSR等位基因。这个数量高于一些先前研究，但低于对地理分布更广、存在地理隔离种群的研究。本研究所涉河流的多样性可能导致了更多等位基因的识别。
我们的研究表明，所有种群的Fis值均为负值，表明杂合子过量。这可能归因于提高杂合子基因型适应性的选择压力。跨位点的杂合子过量与典型的Wahlund效应不符，反而表明了克隆繁殖的普遍存在。由于 S. pectinata 主要进行无性繁殖，长寿的克隆基因型可能保留了历史上成功的、可能是杂合子创始者的遗传特征。另一种可能性是，反复出现的瓶颈效应，随后是克隆扩张，可能有助于维持高适应性的杂合子个体。
4.2. 遗传分化与种群结构
在遗传分化方面，本研究中获得的FST值与在比利时和德国报道的值相当。与波罗的海种群相比，立陶宛不同河流 S. pectinata 种群间更大的隔离可以解释较高的FST值。伊朗种群更高的FST值归因于其显著的地理隔离和生境生态多样性。本研究中使用ISSR标记揭示的遗传分化明显更高，这可归因于显性标记系统的影响。在某些情况下，与共显性标记相比，显性标记表明更高水平的遗传分化。
立陶宛 S. pectinata 种群的主坐标分析和STRUCTURE分析结果相似。PCoA图表明NER种群和部分SES种群基因型位于主要基因型簇之外。STRUCTURE分析将这些基因型组分离成一个独特的基因型库。我们的发现表明，S. pectinata 河流种群间的遗传差异可能由遗传漂变引起，也可能源于局部适应。几个作者的研究表明，生境和当地条件影响种群分化和在PCoA图中的分离。两个基因型库均存在于自然和改造河段地点，表明地点干扰状态不影响这种基因型分组。缺乏显著的统计学差异表明，历史定殖和漂变可能比近期的河流改造对塑造当前遗传结构的影响更大。未发现距离隔离是主要因素。
本STRUCTURE分析中识别的两个基因型库（K=2）可能与先前在眼子菜属分类和分子研究中描述的两个遗传谱系相关。最近的研究揭示了欧洲基因库内的细分，这被解释为反映了淡水和半咸水生态型之间的历史分化。我们的结果显示，NER种群和部分SES种群形成了一个独特的遗传簇，因此可能代表了这种古老分化的残余，可能与对不同盐度或水文条件的局部适应有关。尽管所有立陶宛地点均位于淡水系统，但 distinct 遗传谱系的持续存在可能反映了与波罗的海流域半咸水系统的历史连通性，或不同河流系统种群间的长期生殖隔离。
总体而言，立陶宛 S. pectinata 种群的遗传多样性和结构似乎是历史分化、局部适应和随机进化过程共同作用的结果，而非当代地理或环境因素。NER和部分SES种群分化为 distinct 遗传簇可能代表了祖先遗传谱系的持续存在。未检测到遗传多样性参数与水文化学参数之间的显著相关性，可能反映了中性遗传变异的表现、历史遗传过程与现代环境条件的脱节，以及沉水大型植物强大的表型可塑性和克隆性。SSR标记揭示的高种群内变异性凸显了 S. pectinata 维持相当大遗传多样性的能力，这可能有助于其生态可塑性和广泛分布。
5. 结论
本研究首次使用互补的SSR和ISSR标记，对立陶宛河流中篦齿眼子菜（Stuckenia pectinata）的遗传多样性和结构进行了全面评估。两种标记系统揭示了一致的多样性模式，其中SSR标记捕捉到更大的种群内变异和更精细尺度的遗传分辨率。标记间的一致性表明，观察到的遗传结构反映了进化和种群统计学过程，包括遗传漂变、有限的扩散和克隆性。NER和部分SES种群的分化可能代表了由历史分化塑造的古老遗传谱系的残余。观察到的杂合子过量表明潜在的选择优势，有助于在主要进行营养繁殖的情况下维持遗传多样性。未检测到遗传多样性与水文化学或水文形态学因素之间的显著相关性，表明当前当地环境对Sago pondweed种群结构的影响有限。总体而言，高的种群内遗传多样性凸显了 S. pectinata 的进化潜力和生态恢复力。然而，立陶宛河流中某些遗传多样性参数和遗传丰富度的显著差异，凸显了将分子多样性评估纳入淡水系统监测计划的重要性。
