《Heliyon》：Characterization of chromogenic bacteria using agro-waste extracts as substrate for pigments production
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本研究针对合成染料造成的严重环境污染问题，探索了利用农业废弃物提取物培养产色素细菌生产环保型微生物色素的潜力。研究人员从埃塞俄比亚多样环境中分离出1321株菌株，筛选出6株产色素菌株，其中从火山灰沉积物中分离的Micrococcus luteus在橙皮废弃物提取物中色素产量最高（1.47 g/L）。通过FTIR、UV-Vis和LC-MS分析鉴定该色素为类胡萝卜素化合物，具有温度和pH敏感性。该研究为开发低成本、环保型微生物色素生产技术提供了重要基础，对纺织工业可持续发展具有重要意义。
随着全球纺织工业的快速发展，合成染料的大量使用已成为严重的环境问题。据估计，全球每年生产近8×109吨合成染料，其中约40%具有致癌性，17-20%的工业水污染来源于纺织染料。在埃塞俄比亚，随着政府工业发展战略的推进，纺织服装行业呈现显著增长，2015年纺织加工企业消耗了约1425吨各类染料和化学品，预计未来对合成染料的依赖将进一步加剧。
合成染料因其对光、温度、水和化学物质的高稳定性而在环境中持久存在，有些染料甚至会发生化学反应，产生比原始分子毒性更大的产物，对环境检测构成严峻挑战。更令人担忧的是，约80%的低收入和中等收入国家产生的含染料工业废水未经处理直接排入环境，形成了恶性循环，严重制约生产力发展并威胁生态安全。
在这一背景下，从合成化学染料转向环保型微生物色素成为缓解印染工业环境影响的重要途径。微生物色素具有不受气候条件限制、提供不同颜色、培养技术简单、在廉价培养基上快速生长、生物降解性好等优势。然而，要实现微生物色素商业化生产，产量最大化和生产成本最小化是关键参数，这需要深入研究和优化培养条件。
本研究旨在利用农业废弃物作为生长基质，筛选和表征产色素细菌，探索其作为合成染料环保替代品的潜力。农业废弃物作为农业加工过程的残留物，含有半纤维素、脂质、木质素、蛋白质、淀粉、碳氢化合物、水和单糖等多种化合物，是微生物生长的适宜且廉价的培养基。合理利用农业废弃物还可以减轻未经处理的废弃物处置造成的环境损害。
研究人员从埃塞俄比亚多样生态环境中采集了30份土壤、水和空气样本，覆盖从达洛尔凹地到绍瓦高原的海拔-89米至2375米区域。这些地区物理特征差异显著，达洛尔地区以极端高温和高盐度为特征，而高原则以较凉爽的温度和崎岖地形为特点，为微生物提供了独特的栖息地。
通过系列稀释和划线平板技术，研究共获得1321个分离株，初步筛选出127株呈现不同颜色的菌株，最终纯化得到6株潜在产色素菌株。这些菌株分别来自采石场土壤、温泉、石油污染土壤、火山灰和空气样本，展现了微生物在不同环境中的广泛分布和适应性。
研究人员采用煎煮法制备了11种农业废弃物提取物，包括马铃薯、卷心菜、番茄、橙子、炮弹卷心菜、洋葱、西瓜、木瓜、胡萝卜、香蕉和甜菜根。通过单变量法评估了产色素菌株对不同温度（20-45°C）、pH（4.5-10）、盐浓度（0.5%-5%）、振荡速率（30-150 rpm）以及碳氮源的耐受性。
研究采用形态学、生化鉴定和MALDI-TOF技术对菌株进行鉴定，通过溶剂萃取法提取色素，并利用ATR-FTIR、UV-Vis光谱和LC-MS对提取的色素进行表征。色素稳定性通过暴露于不同温度、pH、氧化剂和还原剂进行评估。
研究结果显示，所有产色素菌株均能在28-45°C、pH 6-10、盐浓度1%-5%以及葡萄糖和酵母提取物分别为1%和0.1%的条件下生长。通过MALDI-TOF分析，菌株被鉴定为玫瑰色库克菌（Kocuria rosea）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、橙黄微小杆菌（Exiguobacterium aurantiacum）和乌氏不动杆菌（Acinetobacter ursingii）。
在这些菌株中，从达洛尔凹地硫磺湖附近火山灰沉积物中分离的藤黄微球菌（PPPI-4）表现出最强的色素生产能力。该菌株在橙皮废弃物提取物中培养时，色素产量达到1.47 g/L，生物量为3.13 g/L。橙皮废弃物富含生物活性物质，包括精油、抗坏血酸、糖类、类胡萝卜素、黄酮类化合物、膳食纤维、多酚、果胶、纤维素、半纤维素和微量元素，为微生物生长提供了理想基质。
色素提取实验表明，甲醇是最有效的提取溶剂，优于乙醇、丙酮和氯仿。通过FTIR光谱分析，色素中检测到羟基、烷烃和烯烃基团，在3204.76 cm-1处出现O-H伸缩振动峰，2925.10 cm-1处为C-H伸缩振动峰，1621.18 cm-1处为C=C伸缩振动峰。
UV-Vis分析显示，色素在476 nm处有特征吸收峰，符合类胡萝卜素（400-550 nm）的典型吸收范围。LC-MS分析进一步证实色素为psi,psi-胡萝卜素-1,1',2,2'-四氢-1,1'-双[(三甲基硅基)氧基]化合物，保留时间为21.14分钟，主要碎片离子m/z=716。
色素稳定性测试显示，该色素对温度和pH变化敏感。随着温度升高，色素吸光度下降，表明高温可能导致色素降解。而在碱性pH范围内，色素吸光度增加，颜色从亮黄色变为淡黄色。相比之下，过氧化氢（氧化剂）和葡萄糖（还原剂）对色素稳定性影响较小。
研究还发现，菌株PPP1-6（鉴定为橙黄微小杆菌）在温度耐受性测试中表现最稳定，平均OD600值为0.63±0.13，变异系数最低（CV=20.45%）。在pH耐受性方面，该菌株也表现出最佳性能，平均OD600值为0.4198±0.16，CV=38.06%。
统计分析显示，不同农业废弃物提取物对菌株生长的影响存在显著差异（F=247890.9，p<1.83×10-48）。橙皮废弃物提取物支持菌株生长的效果最佳，显著优于其他废弃物提取物。温度与菌株生长呈强正相关（r=0.85），盐浓度也与生长显著相关（r=0.85），而振荡速率的影响相对较小（r=0.21）。
本研究系统评估了产色素细菌在农业废弃物提取物中的生长特性和色素生产能力，成功鉴定了一株具有工业化应用潜力的藤黄微球菌菌株。该菌株能够有效利用橙皮废弃物提取物作为生长基质，生产类胡萝卜素类色素，产量可观。
研究结果表明，利用农业废弃物作为微生物色素生产的基质不仅能够降低生产成本，还能实现废弃物的资源化利用，符合循环经济理念。从极端环境中分离的微生物菌株通常具有特殊的适应性特征，可能产生具有独特性质的色素化合物。
然而，研究也指出实验室规模的结果可能不足以直接应用于工业化生产，需要进一步优化培养条件和放大工艺。微生物色素的稳定性虽然不如合成染料，但通过配方优化和稳定剂添加，可以改善其应用性能。
这项研究为开发环保型微生物色素提供了重要基础，拓展了农业废弃物高值化利用的途径，对促进纺织印染行业的可持续发展具有重要意义。未来的研究可以聚焦于工艺放大、色素纯化、应用性能评估以及经济可行性分析，推动微生物色素从实验室走向工业化应用。
该研究的创新之处在于首次在埃塞俄比亚背景下系统研究利用农业废弃物提取物培养多种产色素细菌，并对其中的优势菌株进行详细表征。研究不仅筛选出高性能菌株，还明确了其色素成分为类胡萝卜素，为后续应用开发奠定了坚实基础。
随着全球对环保型产品需求的增加，微生物色素的市场前景广阔。这项研究为解决合成染料环境污染问题提供了可行方案，同时为农业废弃物的资源化利用开辟了新途径，实现了环境保护与资源利用的双重目标。
