《Biocell》：High Expression of KRT6A in Cervical Cancer and Its Promoting Effects on Cell Proliferation and Invasion
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本研究针对宫颈癌(CC)缺乏有效预后标志物和靶向治疗策略的临床难题，系统探讨了角蛋白6A(KRT6A)在CC中的表达及其功能。通过生物信息学筛选、临床样本验证及体内外功能实验，发现KRT6A在CC组织中显著高表达，且与不良病理特征和较差的无进展生存期(PFS)相关。KRT6A敲低可显著抑制CC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果表明KRT6A是CC潜在的独立预后指标和治疗靶点，为CC的精准诊疗提供了新思路。
宫颈癌(CC)是全球女性常见的恶性肿瘤之一，尤其在中国，其发病率仍呈上升趋势，严重威胁女性健康。高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染被公认为是宫颈癌的主要致病因素。尽管目前已有HPV疫苗和筛查项目，但对于晚期患者而言，仍缺乏可靠的早期预警生物标志物和有效的靶向治疗方案。因此，深入探索宫颈癌发生发展的分子机制，寻找新的预后指标和治疗靶点，成为当前研究的迫切需求。
在这一背景下，角蛋白家族成员引起了研究人员的注意。角蛋白(Keratin)是上皮细胞的主要结构蛋白，不仅维持细胞形态，近年研究发现它们还参与细胞运动、信号转导等多种生物学过程。其中，角蛋白6A(KRT6A)在多种恶性肿瘤（如黑色素瘤、肺腺癌）中被证实高表达，并与肿瘤进展和不良预后相关。然而，KRT6A在宫颈癌中的具体表达情况、临床意义及其生物学功能尚不明确。为了解决这些问题，扬州大学附属医院的研究团队在《Biocell》上发表了一项研究，系统揭示了KRT6A在宫颈癌中的致癌作用。
为了回答上述科学问题，研究人员整合运用了多种关键技术方法。首先，他们从GEO数据库（GSE9750数据集）进行生物信息学分析，筛选宫颈癌组织中的差异表达基因。研究采用了包含45对宫颈癌及癌旁组织的临床样本队列（购自上海瑛倍蓝生物技术有限公司）进行免疫组织化学(IHC)验证。在功能机制探索方面，团队通过慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)转染技术，在宫颈癌细胞系（SiHa和HeLa）中构建了稳定的KRT6A敲低模型。体外功能实验包括CCK-8法检测细胞增殖、克隆形成实验(CFA)评估克隆源性、划痕愈合实验(WHA)和Transwell小室实验分别检测细胞迁移和侵袭能力。体内研究则通过裸鼠皮下移植瘤模型，观察KRT6A敲低对肿瘤生长的抑制作用，并利用qRT-PCR和Western blotting(WB)检测基因和蛋白表达变化。所有数据均采用SPSS软件进行统计学分析。
3.1. 基于GEO数据集分析KRT6A在宫颈癌中的水平
研究人员通过对GSE9750数据集的分析，发现KRT6A mRNA在宫颈癌组织中显著高表达（筛选标准为 |log2FC| > 2 且 FDR < 0.05），提示KRT6A可能参与宫颈癌的发生发展。
3.2. KRT6A在宫颈癌组织中的表达水平
免疫组化结果证实，与癌旁正常组织相比，KRT6A蛋白在宫颈癌组织中的表达显著升高（阳性率68.89% vs. 44.44%, p = 0.019），且主要定位于细胞质。
3.3. KRT6A表达与宫颈癌临床病理特征的相关性
将患者分为KRT6A阳性组和阴性组后进行分析发现，KRT6A阳性表达与更高的FIGO分期（III期）、更大的肿瘤直径（>4 cm）以及更差的组织学分化程度显著相关（p值分别为0.007, 0.007, 0.003），表明KRT6A高表达与宫颈癌的恶性进展密切相关。
3.4. KRT6A表达对无进展生存期(PFS)的影响
对患者进行3年随访的生存分析显示，KRT6A阳性组患者的3年PFS率显著低于阴性组（45.16% vs. 78.57%, p = 0.009），中位PFS为25.50个月，提示KRT6A高表达是预后不良的标志。
3.5. 预后因素的单变量与多变量分析
单变量分析显示，KRT6A表达、FIGO分期、肿瘤大小、分化程度和淋巴结转移是影响预后的显著因素。多变量Cox回归分析进一步证实，KRT6A表达（p = 0.044）、肿瘤大小、分化程度和淋巴结转移是宫颈癌患者的独立预后危险因素。
3.6. KRT6A在宫颈癌细胞系中的表达
qRT-PCR和Western blotting检测发现，与永生化宫颈上皮细胞Ect1/E6E7相比，KRT6A在多种宫颈癌细胞系（CaSki, SiHa, HeLa, C33A）中表达上调，尤其在SiHa和HeLa细胞中表达最高，因此选择这两种细胞进行后续功能缺失研究。成功构建KRT6A敲低细胞模型后，验证了敲低效率。
3.7. KRT6A敲低对HeLa和SiHa细胞增殖的影响
CCK-8实验表明，敲低KRT6A后，从第3天（72小时）起，SiHa和HeLa细胞的增殖能力被显著抑制。克隆形成实验也显示，KRT6A敲低细胞的集落形成数量明显减少，证明KRT6A能促进宫颈癌细胞的增殖和克隆形成能力。
3.8. KRT6A敲低抑制HeLa和SiHa细胞的迁移和侵袭
划痕实验显示，KRT6A敲低显著延缓了宫颈癌细胞的迁移愈合速度。Transwell实验进一步证实，敲低KRT6A后，细胞的迁移和侵袭穿过Matrigel基质的能力均显著下降，表明KRT6A对宫颈癌细胞的运动侵袭性至关重要。
3.9. 体内异种移植模型验证KRT6A敲低对宫颈癌细胞增殖的抑制作用
在裸鼠体内实验中，注射KRT6A敲低细胞的实验组，其形成的移植瘤体积和重量均显著小于对照组。对瘤组织的qRT-PCR分析显示KRT6A mRNA水平降低，免疫组化染色进一步发现，实验组瘤组织中增殖标志物Ki-67和KRT6A的蛋白表达水平均明显下调，从体内水平证实了KRT6A的促癌作用。
研究的讨论部分对上述发现进行了深入归纳。本研究首次通过生物信息学、临床样本验证和系统的体内外功能实验，综合证实了KRT6A在宫颈癌中的致癌角色。KRT6A的高表达与肿瘤的侵袭性临床病理特征（如晚期FIGO分期、淋巴结转移、低分化）和患者的不良预后独立相关。机制上，KRT6A敲低能显著抑制宫颈癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。研究人员推测KRT6A可能通过调控上皮-间质转化(EMT)过程或MAPK信号通路（如ERK1/2, p38）来影响宫颈癌的恶性进展，这为后续机制探索提供了方向。
综上所述，该研究确立了KRT6A作为宫颈癌一个新的、有潜力的预后生物标志物和治疗靶点。研究不仅揭示了KRT6A在驱动宫颈癌恶性表型中的关键作用，也为开发针对KRT6A的靶向治疗策略奠定了坚实的理论基础，对改善宫颈癌患者预后、尤其是晚期患者具有重要的临床意义。未来需要更大样本、多中心的研究进一步验证其临床价值，并深入探索其下游分子机制。
