《ACS Catalysis》：A Multi-Functional Heterogeneous Biocatalyst for the Oxygen-Free Oxidative Condensation of Primary Alcohols into β-Hydroxy Acids
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本综述报道了一种新型多功能异相生物催化剂，通过将五种酶（BsADH、ΔNPduP、ReTHL、TtHBDH、EcTesB）共固定于琼脂糖微球，成功构建了无细胞合成体系。该系统利用设计-构建-测试-学习（DBTL）策略，实现了从乙醇到(S)-3-羟基丁酸（3-HBA）的高效转化（产量提升7倍），并通过空间限域效应优化辅因子梯度，解决了氧化还原失衡难题。该催化剂在填充床流动反应器中连续运行3周仍保持50%以上活性，为从简单原料（如塑料废物衍生的乙二醇）合成手性聚合物单体开辟了新途径。
引言
手性分子的生物合成已被广泛研究。羟基酸作为一类多功能手性分子，是合成聚合物和精细化学品的重要砌块。其中，对映体纯的β-羟基酸是工业相关生物聚合物（如聚羟基烷酸酯）和活性药物成分（如降胆固醇药瑞舒伐他汀）的分子基础。3-羟基丁酸（3-HBA）的生物合成是研究最深入的针对β-羟基酸的生物转化之一。尽管化学合成方法存在对映选择性低和可持续性问题，而微生物发酵法通常依赖葡萄糖等底物，开发以乙醇为唯一碳源的高效生物转化路线仍具挑战性。
作为工程化微生物的替代方案，细胞游离系统作为工具包在非生理条件下开发更复杂合成方案方面日益重要。酶工程使得在非自然条件下开发新型反应成为可能。细胞游离系统已实现从葡萄糖、小有机酸和乙烯酯等多种底物生物合成3-HBA及其衍生物。然而，利用短链脂肪醇（如乙醇）通过体外合成代谢途径合成3-HBA仍然面临挑战，主要限制在于从醇形成酰基辅酶A（Acyl-CoA）所需的氧化酰化步骤能垒较高，以及氧化还原失衡问题。
酶固定化到多孔载体上成为解决这些障碍的方案。固定化不仅能增强酶稳定性，还将生物催化剂整合到流动系统中。多酶系统在多孔载体内的空间组织还可以改善活性位点之间的中间体传递，创造有利的颗粒内中间体和辅因子梯度，从而增强整体反应动力学。
结果
工程化沙门氏菌CoA酰化脱氢酶（ΔNPduP）的动力学和底物范围
来自肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）的CoA酰化丙醛脱氢酶（SePduP）催化丙醛氧化为丙酰辅酶A（Propionyl-CoA），使用NAD+作为电子受体，CoA作为酰基受体。本研究制备了N端截短版本ΔNPduP，其溶解度比野生型变体高10倍。该工程化酶表现出广泛的醛范围，对丙醛（2b）的比活性为130 U mg–1。ΔNPduP对短链脂肪醛表现出中等到高的相对活性（>40%），但对大位阻脂肪醛和芳香醛相对活性较低（<20%）。该酶偏好NAD+而非NADP+，因子为10。使用三(2-羧乙基)膦（TCEP）可实现97%的丙酰辅酶A分析产率。
设计和优化用于将伯醇转化为硫酯的异相生物催化剂
将ΔNPduP与能够氧化伯醇的醇脱氢酶（来自嗜热脂肪地芽孢杆菌，BsADH）耦合，实现了伯醇的顺序双氧化和硫酯化以形成相应的酰基辅酶A。该双酶系统使用丙酮/BsADH对作为氧独立的NAD+再生系统。评估了四种固定化化学方法，选择乙醛琼脂糖（AG-G）作为共固定化这两种酶的共识载体。制备了三种具有不同BsADH:ΔNPduP活性比的异相生物催化剂（HB-1.1、HB-1.2、HB-1.3）。具有最高BsADH:ΔNPduP比的异相生物催化剂（HB-1.1）呈现出最高的酰基辅酶A分析产率。
设计和优化用于将乙醇转化为3-羟基丁酸的异相生物催化剂
将HB-1系列与截短的反向β-氧化（rBOX）途径耦合，该途径包括由雷氏罗尔斯顿菌（Ralstonia eutropha）硫解酶（ReTHL）催化的非脱羧克莱森缩合、由嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB27的S-选择性3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶（TtHBDH）催化的不对称还原，以及由大肠杆菌（Escherichia coli）硫酯酶B（EcTesB）催化的最终水解，产生(S)-3-羟基丁酸（3-HBA）。使用可溶性酶未观察到3-HBA的产生，但积累了乙酸，表明乙酰辅酶A发生了不期望的水解。将氧化激活模块和缩合/还原/水解模块分区化成功产生了(S)-3-HBA。将五种酶共固定化在AG-G上制备的多功能异相生物催化剂HB-5.1，其3-HBA滴度比分开固定化的系统提高了20%。计算模型表明ΔNPduP是限速酶，而EcTesB由于其对乙酰辅酶A的非期望水解活性而充当动力学陷阱。根据模型预测，制备了新版本HB-5.2，其ΔNPduP负载量更高，EcTesB负载量更低。在优化条件下，HB-5.2产生了18 ± 0.18 mM的3-HBA，而游离酶系统仅产生2.54 ± 0.037 mM。对辅因子浓度的分析表明，固定化系统内形成了有利于不对称还原的NADH梯度。
HB-5.2对酯、醛和伯醇的范围评估
HB-5.2能够将乙醛、乙烯乙酸酯、乙酯（如乙酸乙酯）以及生物乙醇转化为3-HBA。使用回收的乙酸乙酯也能产生相似的3-HBA滴度，展示了该生物催化剂升级循环溶剂的能力。此外，HB-5.2还能利用乙二醇（可能源自塑料废物）和1-丙醇等底物，产生二羟基、三羟基和α-支链的β-羟基酸，如3,4-二羟基丁酸和3-羟基戊酸。
HB-5.2的操作稳定性及其用于连续合成3-HBA的实施
在分批间歇模式下，HB-5.2可重复使用7个周期，在前3个周期中3-HBA滴度稳定。在填充床流动反应器（PBR）中连续操作时，系统在36小时内保持20 mM的稳定3-HBA滴度，并在运行573小时（近24天）后仍保持50%的生产率。反应器出口溶液中的3-HBA通过液-液有机相萃取分离，分离产率为56%。事后分析表明，操作失活主要归因于ΔNPduP的失活和浸出。
结论
本研究开发了一种具有极高理论质量产率（113%）的体外酶促级联反应。通过整体生物催化剂工程策略，克服了热力学不利因素，实现了从乙醇高效合成(S)-3-HBA。酶共固定化显著增强了操作稳定性，并允许在连续反应器中进行过程强化，实现了如此复杂系统前所未有的使用寿命。该系统灵活高效，可利用可再生乙醇、乙酯和乙烯酯等不同原料。此外，该系统还能缩合比乙醇更大的醇，从而通过前所未有的途径获得二羟基、三羟基和α-支链β-羟基酸。这项研究为利用固定化酶系统强化体外级联反应，将简单、低成本、可持续的原料转化为高价值产品奠定了基础。
