《Molecular Microbiology》：An Improved Description of the Small RNA Landscape of the Human Fungal Pathogen Aspergillus fumigatus
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这篇综述系统阐述了人类病原真菌烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）在标准实验室条件下有限的小RNA（sRNA）产生机制。研究通过诱导经典RNA干扰（RNAi）通路，发现Dicer-like B（DclB）依赖性的20核苷酸（nt）5′尿苷（5′ U）小RNA主要从反向重复转基因（inverted-repeat transgene）的3′端靠近环状结构区域产生。文章评估了三种RNAi通路双敲除菌株（ΔdclA/B、ΔppdA/B、ΔrrpA/B）中的sRNA生物发生，发现内源性5′ U小RNA的产生在很大程度上不依赖于RNAi机制，而丰富的tRNA来源RNA（tDRs）的生物发生则主要独立于Dicer-like蛋白。研究采用先进的tDR测序技术，揭示了分生孢子（conidia）相对于菌丝体（mycelium）小RNA组分中tRNA半分子（tRNA-half）的定性形态特异性变化。尤为重要的是，研究发现即使在缺乏双链RNA（dsRNA）加工和小RNA产生的情况下，过量表达dsRNA仍能抑制真菌生长，提示烟曲霉菌对dsRNA水平升高具有敏感性，这为未来研究dsRNA代谢提供了一个有趣的模型系统。
引言
经典RNA干扰（RNA interference, RNAi）通路通过将双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）切割成小RNA（small RNA, sRNA），进而作为向导分子沉默靶标转录本。dsRNA前体分子可内源性产生，也可外源性引入。dsRNA的A型螺旋结构使其成为多种dsRNA结合蛋白（dsRNA binding proteins, dsRBPs）的底物。真菌的sRNA景观具有异质性，包括来自完全配对dsRNA或具有凸起/错配dsRNA结构的小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）和微RNA样RNA（microRNA-like RNA, milRNA）。真菌sRNA通过多种生物发生途径产生，通常涉及核心RNAi机制成员，如RNase III酶Dicer（或Dicer-like）、Argonaute和/或RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）。烟曲霉菌作为一种普遍存在的人类病原真菌，拥有活跃的RNAi通路，但在标准生长条件下仅产生有限的内源性sRNA池，其中大部分是tRNA来源的RNA（tRNA-derived RNA, tDR）。
tDRs是一类新兴的异质性sRNA，长度在10至50核苷酸（nt）之间，包括5′和3′ tRNA半分子（tRNA halves, tRHs，约31-40 nt）、长度为17-25 nt的tRNA片段（tRNA fragment, tRF，如tRF-5、tRF-3、tRF-3 CCA、内部tRF等）。tDRs的产生是多因素且动态变化的，依赖于如RNase A核糖核酸酶血管生成素、RNase T2型酶（如酵母中的Rny1p）或某些物种中的Dicer等酶。在烟曲霉菌中，tRHs在从分生孢子萌发为菌丝的过程中积累，且在早期分生孢子发生期间tRHs迅速增加而成熟tRNA水平下降，这可能与孢子代谢休眠和翻译关闭有关。tRF-3已知可与含有Argonaute的RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）相互作用，基于3′非翻译区（3′ UTR）种子序列互补性引导靶标mRNA沉默，并参与核糖体RNA加工。
本研究旨在利用sRNA测序（sRNA-seq）和tDR测序（tDR-seq）方法，对世界卫生组织（WHO）列为关键优先病原体的烟曲霉菌的sRNA景观和dsRNA代谢进行更精确的全局表征。
结果
2.1 烟曲霉菌RNAi机制将反向重复转基因dsRNA加工为20-nt、5′ U-containing sRNAs
通过过表达针对非必需基因pksP的反向重复转基因（pksP IRT），研究人员在野生型烟曲霉菌中观察到靶基因沉默和液体培养中意外的生长抑制。sRNA-seq分析显示，在诱导pksP IRT表达的野生型菌株中，从转基因产生了主要富集20-nt长度和5′尿苷（5′ U）的sRNAs。这些sRNA的积累主要源自转录本3′半部分（反义链），大致为两个连续的20-nt RNA。这种sRNA的产生模式在ΔppdA/B和ΔrrpA/B pksP IRT表达菌株中依然存在，但在ΔdclA/B IRT菌株中消失。进一步的实验证实，DclB（而非DclA）是产生这些5′ U-containing sRNAs所必需的。使用另一个pabA IRT进行的验证实验得到了相似的结果，即主要从转录本3′端产生20-nt、5′ U-containing sRNAs，表明DclB对发夹RNA的切割具有偏好性。
2.2 烟曲霉菌内源性sRNA的组成具有形态特异性
研究人员对在野生型CEA17ΔakuBKU80背景中创建的三种RNAi通路双敲除菌株（ΔdclA/B、ΔppdA/B、ΔrrpA/B）以及野生型对照，在正常生长条件下（分生孢子、24小时菌丝体、48小时菌丝体）进行了sRNA-seq分析。结果显示，在分生孢子中，大量读数映射到核糖体RNA（rRNA），而在菌丝体样本中，tDRs和其他小非编码RNA（small non-coding RNA, sncRNA）的比例增加，这与代谢活跃菌丝体中更复杂的转录组预期一致。在所有测序样本中，rRNA构成了映射读数的绝大部分，其次是映射到tRNA基因的短读数。对源自rRNA的19-25 nt小RNA的分析未发现5′核苷酸序列偏好，且RNAi组分的缺失未引起明显变化。通过Manatee软件预测sRNA（包括milRNA），发现在分生孢子中候选sRNA较少，在24小时和48小时菌丝体中则有数量更多、丰度略高的候选sRNA。然而，删除dclA/B并未改变鉴定到的候选sRNA总数，而缺失ppdA/B和rrpA/B则减少了Manatee鉴定到的sRNA数量，但这些候选sRNA大多丰度不高，且不同菌株间重叠有限，差异主要由一些看似随机的tDRs驱动。这些结果与烟曲霉菌中符合milRNA标准的sRNA池有限的研究一致，其sRNA更多来源于结构RNA（如tRNA和rRNA）的片段。
2.3 烟曲霉菌中tDR的生物发生主要不依赖于RNAi机制
对tDR部分的详细分析显示，从分生孢子到较老的菌丝体，核编码的5′-tRHs相对丰度增加，但同时检测到大量tRFs，这些tRFs可能由成熟或前体tRNA切割产生（例如通过RNase T2）。对于核编码的tRFs，小RNA组分中tRF-5的相对丰度从分生孢子到24小时和48小时菌丝体（此时营养更为有限）增加，而tRF-3部分则在这些样本中减少。对于线粒体编码的tDRs，读数主要映射到tRF-3、5′-tRHs和tRF-5。通过unitas软件包创建的各tRNA的tDRs标准化丰度热图显示，不同形态型间tDRs的相对丰度存在巨大差异。与野生型相比，某些RNAi敲除菌株（尤其是ΔppdA/B）的tDR丰度比率存在轻微但统计学上显著的差异。在分生孢子中，ΔppdA/B似乎从许多tRNA产生更少的tRF-3衍生物。令人惊讶的是，在ΔdclA/B菌株中tDRs的产生差异极小。这些结果表明，RNAi机制，特别是Dicer-like蛋白，在标准生长条件下对烟曲霉菌tRNA片段的产生不起主要作用。
2.4 tDR-Seq揭示真菌形态型间tDR模式的改变
为了解决标准测序方法在检测tRNA方面的局限性（如接头连接效率低和逆转录效率下降），研究人员采用了tRF & tiRNA测序（本文称为tDR-seq）方法，该方法通过修复RNA末端和去除常见甲基化修饰来分别促进连接和读通。分析显示，与sRNA-seq相比，tDR-seq揭示了核编码tRNA中tRHs的相对比例更高，这与旨在改善末端检测的方法一致。有趣的是，在分生孢子中，核来源的5′ tRHs相对丰度（约75%）远高于菌丝体条件。进一步分析发现，分生孢子中鉴定到的大部分tDRs（约73%）来自一个特定的Asp(GTC)核编码tRNA，其中5′ tRH是最丰富的片段。核编码tRNA片段的长度更符合tRHs，而线粒体编码的tDRs长度范围更广，在菌丝体中相对富集较小的片段。对每种tRNA的tDR丰度热图分析再次揭示了不同tRNA（甚至具有相同同工受体者）之间在丰度和片段分布上的显著差异。许多核编码tRNA似乎具有稳定的tRF-3 CCA片段，其中先前鉴定出的Tyr(GTA)-tRF-3 CCA是最丰富的片段之一。tDR的每百万读数计数通常在24小时菌丝体中相对于分生孢子增加。这些结果共同证实了sRNA-seq数据的发现，即烟曲霉菌的小转录组在标准生长下主要由结构RNA（如rRNA和tRNA）来源的sRNAs构成，且其在小RNA组分中的相对丰度因形态型而异。
2.5 dsRNA过表达抑制烟曲霉菌生长且不依赖于Dicer-Like蛋白
鉴于从pksP IRT产生的sRNAs除靶标pksP mRNA外没有预测到脱靶位点，研究人员假设高水平的dsRNA本身可能对烟曲霉菌有害，或许是通过与内源性途径竞争底物。烟曲霉菌注释有10个dsRBPs，其中包括5个推定的RNase III酶（两个Dicer-like蛋白、一个线粒体RNase III酶、一个核仁RNase III酶Rnt1和一个功能未知的小RNase III结构域蛋白）以及其他5个研究较少的dsRBPs（部分参与rRNA组装或功能）。之前发表的mRNA-seq数据表达谱分析显示，这些基因中许多具有阶段特异性表达，且常受核心RNAi组分表达的影响，表明在不同生长阶段可能有特定的蛋白质亚群竞争dsRNA结合。
为了验证sRNA产生在观察到的pksP IRT生长抑制效应中的作用，研究人员在液体培养中测试了pksP IRT在缺失dicer-like蛋白组分情况下的影响。出乎意料的是，即使在无法产生sRNAs的ΔdclA/B和ΔdclB菌株中，诱导IRT表达仍能限制真菌生长，尽管程度略有不同。这种生长破坏与sRNA产生无关，表明sRNAs的脱靶效应并非生长停滞的主要驱动因素。相反，dsRNA本身可能作为生长停滞的信号。高水平的dsRNA可能与dsRBPs竞争内源性底物，从而阻碍正常生物学过程，类似于活跃复制的反转录转座子。这种机制可能为响应异常高水平的dsRNA提供一种天然的生长制动，并使未受影响的细胞获得优势。值得注意的是，先前研究表明在类似生长条件下过表达单链mRNA不会导致生长抑制，这为dsRNA本身可能具有抑制作用的观点提供了额外支持。
讨论
本研究通过利用sRNA-seq和tDR-seq，提供了对烟曲霉菌sRNA景观的改进描述。烟曲霉菌的tDRs池似乎是异质性、动态的，并且在标准生长条件下主要独立于经典RNAi机制。研究利用有限的内源性sRNA景观，评估了烟曲霉菌在诱导反向重复转基因后产生的sRNAs特征。观察到源自pksP-IRT转基因的5′ U-containing 20-nt sRNAs积累，且这些sRNAs主要从500-bp dsRNA的3′半部分的两个连续位点产生，这并非意外，但值得注意的是，sRNAs在野生型和ΔdclA IRT菌株中产生，但在ΔdclB或ΔdclA/B菌株中不产生，证实了DclB是烟曲霉菌从IRT产生小RNA所必需的。对另一个pabA IRT表达菌株的测序再次显示了主要从转录本3′端富集5′-U-containing 20-nt sRNAs，提示DclB切割发夹RNA具有保守特征。
对两个不同形态生长阶段的小非编码RNA动态评估发现了预期类别的小非编码RNA，其中源自rRNA和tDRs的读数在分生孢子和菌丝体中丰度最高。尽管这可能是RNA降解的潜在迹象，但结合质量控制步骤和文献，表明rRNA和tRNA来源的RNA确实在生命周期中积累，特别是在较晚的生长时间点（如48小时菌丝体）。观察到的tDRs丰度与先前在相同生长条件下使用Nano-tRNAseq测量的菌丝体总体tRNA丰度不相关，这支持了tDR生物发生是烟曲霉菌中受调控过程而非 solely RNA降解产物的假设。
一些先前研究表明RNAi组分如Dicer在tDR生物发生中起作用，但本研究结果表明烟曲霉菌Dicer-like蛋白在标准生长条件下作用微小。与野生型相比，确实观察到ΔppdA/B分生孢子中某些tDRs产生略有减少，而在较晚生长阶段（如48小时菌丝体）增加。Argonaute蛋白已知在某些系统中稳定tRFs，并且ΔppdA/B菌株中易受切割的成熟tRNAs总池可能较低，但这需要进一步研究。值得注意的是，在ΔppdA/B pksP IRT sRNA-seq实验中未观察到sRNAs的丢失，表明Argonautes可能在烟曲霉菌sRNA稳定中不起主要作用。
tDR-seq方法与sRNA-seq相比，揭示了tRHs的富集池，这与文献一致。tDR-seq数据集显示了rRNA读数的丰富性、较小比例的tDRs和其他RNA。与sRNA-seq相比，tDR-seq在分生孢子中tRH检测的增加程度令人惊讶，这可能暗示分生孢子中RNA末端状态的独特生物化学特性，或许是为了RNA的长期保护。
最后，评估反向重复转基因过表达在缺乏dicer-like蛋白组分情况下诱导液体培养生长停滞的能力时，惊讶地发现即使RNAi系统被破坏，生长仍受到限制。这表明生长破坏独立于sRNA产生，dsRNA本身可能作为生长停滞的信号。高水平的dsRNA可能与dsRBPs竞争内源性底物并阻碍正常生物学。这种机制可能为响应异常高dsRNA水平提供天然制动。未来需要使用催化失活的RNAi机制进行互补实验来完全理解其作用机制。
结论
本研究（1）揭示了烟曲霉菌在dsRNA诱导下依赖DclB产生经典的20-nt、5′ U-containing小RNA；（2）利用sRNA-seq和tDR-seq进一步定义了主要由rRNA和tRNA来源RNA构成的有限内源性小RNA池的动态；（3）提出了一个关于烟曲霉菌中dsRNA代谢与独立于sRNA产生的生长停滞之间联系的引人入胜的假说，值得未来进一步研究。
实验方法
菌株、培养条件和生长测定：烟曲霉菌菌株在曲霉菌基本培养基（Aspergillus minimal medium, AMM）琼脂平板和液体培养物中培养。用于测量干重的实验如前所述进行。对于IRT-sRNA-seq，孢子接种后培养指定时间，并加入诱导剂。
RNA分离：分别针对IRT-sRNA-seq以及sRNA-seq和tDR-seq采用了不同的组织裂解和RNA提取方案，均涉及TRIzol提取、DNase处理和纯化步骤。
文库制备和测序：sRNA-seq文库由Novogene使用TruSeq Small RNA Library Preparation Kit制备，并在NovaSeq 6000仪器上测序。tDR-seq由CD Genomics进行，包括对tRNA特定修饰的处理（如3′脱酰化、3′-cP移除、5′-OH磷酸化、m1A和m3C去甲基化），然后在Illumina HiSeq 2500仪器上测序。
数据分析：使用TrimGalore进行质量控制和接头去除。使用SortMeRNA去除rRNA读数（但此步骤未改变分析结果，后续分析中省略）。使用unitas软件包（v. 1.7.0）和烟曲霉菌A1163 ASM15014v1参考基因组进行分析。核tRNA参考GtRNAdb，线粒体tRNA通过tRNAscan-SE从线粒体基因组扫描预测。所有分析使用R语言和相应软件包进行。统计显著性设定为p < 0.05。
