《Plant Physiology and Biochemistry》：The AeMYBs responding to CMCS cooperatively regulate the phenylpropanoid pathway to participate in postharvest lignin biosynthesis of okra
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本研究针对秋葵采后木质化导致的品质劣变问题，通过解析羧甲基壳聚糖（CMCS）调控下关键AeMYB转录因子（AeMYB6, AeMYB315-1, AeMYB315-2）协同调控苯丙烷途径参与木质素合成的分子网络。结果表明，这三种AeMYBs为核定位蛋白，可直接结合AePALs、AePODs等基因启动子，上调其表达及PAL、POD、4CL、CAD酶活性，影响木质素单体代谢，从而协同调控木质素积累。该研究为揭示CMCS延缓秋葵采后木质化的机制提供了重要科学依据，对果蔬采后保鲜技术开发具有理论意义。
秋葵，这种营养丰富的蔬菜，在采后贮藏过程中常常面临一个棘手的难题——木质化。这会导致其口感变硬、品质下降，严重制约其经济价值。木质化的核心是木质素的过度积累，而木质素的合成主要依赖于苯丙烷代谢途径。此前研究发现，多糖类保鲜剂羧甲基壳聚糖（CMCS）能够有效延缓秋葵采后木质化，但其背后的分子机制，特别是关键转录因子如何响应CMCS信号并调控下游木质素合成通路，尚不清晰。为了破解这一难题，揭开秋葵采后品质调控的分子面纱，研究人员在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了他们的最新研究成果。
为了深入探究这一问题，研究人员综合运用了多种分子生物学技术。他们首先对经CMCS处理的秋葵样本进行了基因表达分析。通过生物信息学分析，系统筛选了潜在的调控因子。研究的关键在于功能验证：利用亚细胞定位技术明确了AeMYB蛋白的细胞核定位；通过双荧光素酶报告基因（DLR）实验和酵母单杂交（Y1H）实验，在体内和体外验证了AeMYB转录因子与下游靶基因启动子的直接结合能力；进一步通过瞬时过表达技术，在烟草和秋葵叶片中研究了AeMYB过表达对下游基因表达、关键酶活性以及木质素相关代谢物的影响。此外，还采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术对代谢物进行了精准定量。
3.1. CMCS对秋葵果实木质素相关基因表达的影响
研究人员分析了苯丙烷生物合成途径中10个关键结构基因的表达水平。结果发现，在冷藏期间，这些基因的表达整体呈上升趋势，尤其是AePODs基因。与第0天相比，空白组中AePOD1、AePOD2、AePOD3和AePOD4的表达量在第10天分别增加了120倍、1459倍、159倍和141倍。而CMCS处理则抑制了AePODs的表达。此外，贮藏第15天时，AePAL2/3/4、Ae4CL和AeCAD的表达水平有所下降，但CMCS处理组的表达量高于对照组。对启动子的顺式作用元件分析发现，这些结构基因的启动子区域包含多个MYB转录因子结合位点，如AC-I、AC-II、MYB识别位点等。这表明CMCS可能通过下调这些结构基因的表达来减缓木质素积累，而这些基因的表达很可能受到MYB转录因子的调控。
3.2. AeMYBs的鉴定与亚细胞定位
研究共筛选了15个AeMYBs进行后续分析。系统发育树和蛋白质结构分析表明，AeMYB6、AeMYB315-1/2/3等均含有典型的R2和R3结构域，属于R2R3-MYB转录因子。鉴于AeMYB6和AeMYB315-1/2在先前研究中表达量较高，本研究将这三种确定为核心转录因子进行深入分析。亚细胞定位实验证实，AeMYB6、AeMYB315-1和AeMYB315-2与绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白信号仅能在细胞核中观察到，且与核定位染料DAPI的蓝色荧光基本重合，证明这三种AeMYB蛋白均为核定位蛋白。
3.3. DLR相互作用结果
DLR实验用于验证AeMYB在体内对上述结构基因的调控作用。结果表明，三种AeMYB对10个结构基因的反式调控作用既包括激活也包括抑制。例如，AeMYB6可以反式激活AeCAD和AePOD1，同时反式抑制Ae4CL和AePAL1/2/3/4。AeMYB315-1可以反式抑制Ae4CL并反式激活AePAL2。AeMYB315-2对Ae4CL、AeCAD和AePOD1/2/3/4的调控作用与AeMYB315-1一致，并能反式抑制AePAL1/2/4的表达。这些结果说明，AeMYB6、AeMYB315-1和AeMYB315-2可以通过反式调控结构基因的表达来协同调控木质素合成。
3.4. Y1H测定结果
Y1H实验进一步在体外验证了AeMYB与结构基因的相互作用。结果显示，AeMYB6可以直接结合AePOD1/2/3/4和AePAL1/2/3的启动子并调控其转录表达。AeMYB315-1可以直接结合AePAL1/2/3/4的启动子。AeMYB315-2可以直接结合AePAL1/2/3/4的启动子。综合来看，这三种AeMYB转录因子能够直接与多个关键结构基因的启动子区域结合。
3.5. 瞬时过表达AeMYBs对相关基因的影响
瞬时过表达实验表明，在植物体内，过表达三种AeMYB均能上调苯丙烷途径中多个结构基因的表达，包括AePALs、Ae4CL、AeCAD和AePODs。例如，AeMYB315-1过表达组中四个AePALs的表达量相较于对照组分别提高了8倍、6倍、20倍和13倍。这直接证明了AeMYB转录因子对下游木质素合成通路基因的激活作用。
3.6. AeMYBs过表达对酶活性的影响
酶活性检测发现，过表达AeMYB对参与木质素合成的关键酶（PAL、POD、4CL、CAD）的活性具有调控作用，但这种调控存在组织特异性。例如，在秋葵中，AeMYB315-1和AeMYB315-2的过表达激活了PAL活性，而AeMYB6则表现出抑制作用。在烟草和秋葵中，三种AeMYB的过表达均能激活POD、4CL和CAD的活性。这表明AeMYB通过调控酶活性来影响木质素合成通路的总流量。
3.7. AeMYBs过表达对木质素代谢物的影响
代谢物水平分析显示，过表达AeMYB影响了关键木质素前体和中间代谢物的含量。例如，在烟草中，过表达AeMYB6增加了L-苯丙氨酸的含量，而AeMYB315-1和AeMYB315-2则降低了其含量。三种AeMYB过表达均降低了4-羟基肉桂酸和咖啡酸的含量。这些变化表明，AeMYB确实在代谢水平上调控了木质素的合成过程。
归纳研究结论与讨论部分，本研究首次系统地揭示了CMCS通过调控AeMYB6、AeMYB315-1和AeMYB315-2这三个关键R2R3-MYB转录因子，进而协同调控秋葵采后苯丙烷途径基因表达、酶活及代谢物合成，最终影响木质素积累的分子机制。研究不仅证实了这些转录因子与下游靶基因启动子的直接结合能力，还通过瞬时过表达验证了其功能，描绘了一个复杂的转录调控网络。值得注意的是，AeMYB6（可能与木质素负调控因子AtMYB3同源）和AeMYB315-1/2（与木质素正调控因子AtMYB61聚类）可能分别扮演抑制和激活的角色，这种精细的协同与拮抗作用共同精确调控着秋葵采后的木质化进程。该研究的重要意义在于为解析CMCS这一绿色保鲜剂的作用机制提供了深入的分子见解，为未来开发靶向调控果蔬采后木质化的新技术策略奠定了坚实的理论基础。同时，研究也指出当前存在的局限性，如秋葵同源转化体系的缺乏、转录因子互作网络尚不清晰等，为后续研究指明了方向。
